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肝癌转移相关蛋白及其兔单克隆抗体的筛选和鉴定

彭艳  
【摘要】:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,每年全世界死于肝癌的患者约达125万人,我国是肝癌高发区,占世界上肝癌总死亡人数的53%。因此寻找肝癌不同发展阶段的特异性、相关性蛋白,进行肝癌的发生、发展、转移和预后方面的研究尤为重要,据此不仅可以进行早期诊断,判断预后,还有助于筛选新的药物靶点,开发新的治疗药物和治疗手段,降低肝癌的死亡率。 蛋白质组学作为一种新兴的技术,已成为疾病发病机理以及新药研发的强有力工具。目前疾病蛋白质组学所依赖的技术平台仍然以2DE-MS为主,即首先应用2DE比较正常状态与疾病状态的蛋白组,通过差异图谱发现差异表达蛋白,然后用MS对这些差异蛋白进行鉴定,并从这些差异蛋白出发进一步研究疾病发生发展的机理、诊断标志物或治疗靶点。虽然2DE目前仍是应用最广泛的一种技术路线,但其分离能力有一定限度,重复性差,难以检测到对生理和病理过程具有关键性调节作用的低丰度和难溶水的蛋白。因此目前国际上开始重视研究以高效液相色谱方法(HPLC)为主的技术平台,特别是与各种模式质谱串联的多维色谱分离技术逐渐克服2DE存在的缺陷。通常与质谱联用的多维色谱分离方法是基于两种或两种以上不同分离机理方法的优化和组合,其分离量为几种模式色谱分离量的总和。二维液相色谱分离法包括液相状态下的色谱聚焦(第一维)及无孔硅胶反向HPLC分离(第二维)。从第二维洗脱的蛋白质可用电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)直接检测,或用基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)测定分离蛋白的完整分子量。该方法具有几个重要的优点:(1)灵敏度高,有利于低丰度蛋白质的检测,无孔硅胶柱的无孔键合相更有利于蛋白质的快速、高分辨的分离;(2)容易自动化,可直接与质谱连接,二维液相色谱分离方法可提供溶液状态下的纯蛋白,因此可以使用ESI-MS或MALDI-MS分析而获得高精确的完整蛋白质的分子量;(3)分辨率高,可获得更精细的蛋白质表达谱信息;(4)重现性很好。应用二维液相快速色谱分离方法研究蛋白质组差异将成为寻找癌症等疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 肝细胞肝癌的高复发率己经成为进一步提高患者术后长期生存率的最大障碍。 所以肝癌的转移复发研究具有十分重要的意义。复旦大学肝癌研究所近年来建立了 人的高、低转移肝癌细胞株MHCC97一H和MHCC97一L。MHeC97一H表现出2 00%的 肺转移能力,而MHCC97一L仅发生40%的肺转移。该模型为研究肝癌的转移复发奠 定了良好的基础。我们利用二维液相色谱分离法对人不同转移潜能的肝癌细胞株进 行了差异蛋白质组分析,并对其中的差异峰进行了质谱鉴定及功能分析。 Kohler和Milstein于1 975年创立的单克隆抗体杂交瘤技术不仅为医学与生物学 基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。1995年, K五ight成功地在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤印lasmacytoma)。其后几年里,Pytela 和Zhu将此技术进行了改进,使之能高产量的生产兔单克隆抗体。兔单克隆抗体的 出现带来了许多好处。首先,兔抗血清通常含有高亲合力抗体,可以比鼠抗血清识 别更多种类的表位;其次,兔单克隆抗体能够识别许多在小鼠中不产生免疫的抗 原;第三,可以进行更多的融合实验,使得高通量筛选融合细胞成为可能;第四, 复合方式高通量生产单克隆抗体,允许通过一个复合方式免疫多种抗原,而不是一 个抗原一次免疫一个动物。虽然可以用混合抗原一次性免疫一个动物以产生针对多 种抗原的单克隆杂交瘤细胞株,但是如何确定每种单克隆抗体的靶抗原却是一个难 题。我们将二维液相色谱法分离的肝癌细胞株的全蛋白进行SDS一PAGE,并用杂交 瘤的上清液进行westem blot分析,再对单克隆抗体所对应的靶抗原的条带进行质谱 鉴定。这样就大大提高了单克隆抗体的筛选效率,也将加速疾病目标蛋白的证明和 检验的过程,并为进一步研究其功能提供了有利的工具。 研究目的 1、筛选和鉴定肝癌转移相关蛋白,评价其作为诊断标记和药物靶标的可能性; 2、筛选和鉴定肝癌特异性兔单克隆抗体。 研究方法 1、细胞样品的制备 收集不同转移潜能的肝癌细胞株(高转移肝癌细胞株MHCc97一H、低转移肝癌 细胞株MHCC97一L和无转移特性的肝癌细胞株sMMc7721)约105细胞,加入细胞 裂解缓冲液,上清用初始缓冲液置换。BCA法测定蛋白浓度。 2、二维液相色谱分离 第二军医大学博士学位论文 中文摘要 利用二维液相色谱仪PRoTEMELABTM PFZD和其配套试剂盒(贝克曼库尔特 公司)进行不同转移潜能的肝癌细胞株裂解液的蛋白质组差异分析。一维色谱聚焦 分析流动相为初始缓冲液印H值8.5士0.1)、洗脱缓冲液(pH值4.0士0.1),流速为0.2 mL/min;检测波长为280nln;流动相的pH值由pH计在线监测,每间隔0.3个pH 单元收集一份样品,共收集巧个样品。pH值大于8.5和小于4.0的部分每隔5 min收 集一次样品。将一维分离的样品分别进行二维分析,流动相A为0.10%TFA的水溶 液,流动相B为0.08%TFA的乙睛溶液;检测波长为UV 21 4nm;洗脱梯度为O- 100%B,30 m


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