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卵巢癌相关新基因NM23-H1B的克隆和功能研究

李文  
【摘要】:卵巢癌是一种严重危害妇女健康和生命的女性生殖器恶性肿瘤,发病率居女性恶性肿瘤的第六位,女性生殖系统恶性肿瘤的第三位。死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤首位。临床上卵巢癌的治疗方法为手术切除为主,辅以联合化疗的综合治疗。但由于卵巢癌早期发现困难,极易发生多途径、多部位的转移,临床治疗效果多不理想,5年生存率始终徘徊在20-40%。因此抑制转移成为提高治疗卵巢癌效果的关键。基因是所有生物遗传信息的物质基础,决定了一切生命现象的形式和内容。随着人类基因组计划的实施,卵巢癌的发病机制和治疗的研究已经跃入基因水平。但从目前的研究和临床治疗预后效果来看,尚无明显突破性进展,主要难题是缺乏有效的卵巢癌特异性的分子治疗靶标。肿瘤的侵袭与转移是一个复杂的生物学活动,有一系列的基因参与其中。寻找和发现与肿瘤转移相关的基因有助于理解卵巢癌的侵袭进展中发生的分子生物学改变,从而找到抑制肿瘤的转移和播散的基因治疗的新方向。NM23基因是显著的转移抑制基因,并与细胞的生长、分化以及肿瘤的发病机理相关。 本课题在复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室和联合基因科技集团有限公司以独创的“高效循环差减杂交全长cDNA克隆技术”取得的具有完整的编码蛋白信息的、在各种公开数据库中未曾发表过的、代表成熟mRNA序列的cDNA克隆及其序列为基础,构建了人类胎脑cDNA文库并进行了大规模的测序,作者将其中的全长人类新基因序列输入数据库,并通过基因表达谱芯片数据筛选出在肿瘤组织中表达差异的基因。其中有一条人类新基因cDNA序列与小鼠的NM23基因和人类的NM23-H1、NM23-H2高度同源。根据生物信息学分析,认为该cDNA是NM23-H1的不同剪切体(NM23-H1B)。该cDNA全长987bp编码一个177氨基酸的蛋白,新NM23-H1B蛋白中含有核苷二磷酸激酶结构域(符合度100%)和酪蛋白激酶磷酸化位点结构域(Casein kinase Ⅱ phosphorylation site)(19-22氨基酸,SSCD)。与NM23-H1蛋白相比,NM23-H1B在氨基端多了额外的25个氨基酸。NM23-H1 B定位于人染色体17q21.3,并且第2个外显子不存在于NM23-H1(NM23-H1A)。 第二军医大学博士论文 卵巢癌相关新基因NM23一HIB的克隆及功能研究 本课题通过设计特异性的新基因NM23一HIB引物进行RT一PCR实验,用正常 组织Clontech的Panel试剂盒验证了新基因NM23-HIB的存在。发现新基因 NM23.HIB在正常成人的十五种组织中都有表达:在脑组织、胎盘组织、肺组织、 肝脏、骨骼肌、卵巢组织、外周血细胞、肾脏、胰腺组织和胸腺组织中表达量相 对较高;而NM23一H了B在心脏、脾脏、前列腺组织、翠丸组织和小肠组织中的表 达量较低。肿瘤(如肝癌、胃癌、胰腺癌等)芯片表达谱分析,发现新基因NM23一H了B 与多种肿瘤存在相关性。 本课题应用R下一PCR、Northern杂交和原位杂交等实验方法研究新基因与卵 巢癌相关的功能。通过RT一PCR方法,在正常卵巢组织和卵巢肿瘤(包括交界性 卵巢肿瘤和卵巢癌)中证实了存在NM23一HIB基因mRNA的表达,并且在卵巢肿 瘤中的表达明显高于正常卵巢组织。进一步用Northern杂交实验对上述组织中 mRNA的表达进行分析,发现与正常卵巢组织和交界性卵巢肿瘤相比,卵巢癌组 织中NM23一H,B明显高表达,而且在早期卵巢癌中的表达明显高于晚期卵巢癌, 并且高分化卵巢癌中的表达量较高。原位杂交实验发现NM23一H,B广泛分布于卵 巢癌组织中,mRNA表达产物主要位于细胞浆内,部分位于胞膜上,个别位于细 胞核上;正常卵巢组织中表达均为阴性或极低表达,卵巢交界性肿瘤(LMP)中 表达阳性率比正常卵巢组织略高,但均为极弱阳性。与Northem杂交的结果相似。 本课题提示NM23一HIB基因与卵巢癌有明确的相关性,可能对卵巢癌的发展 有抑制作用,这种作用可能发生在肿瘤的早期,可能是通过促进肿瘤的分化实现 的。


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