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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白口服核酸疫苗实验研究

杨骅  
【摘要】:摘 要 一、研究背景 幽门螺杆菌(H. pylori)感染为慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。抗生素联合制酸剂为目前H. pylori感染主要的治疗方案,但随着细菌耐药、药物不良反应及药效经济学等问题的突出,研究接种简便、成本低廉并易于大面积推广的H. pylori口服疫苗越来越受到重视。 DNA疫苗因可诱导全面的免疫应答、提供同种异株交叉保护作用、易于制备多价疫苗、兼有预防和治疗作用等特点在多种疾病的防治中显示出巨大的应用潜力。而与传统疫苗相比,活减毒鼠伤寒沙门菌这一新型口服疫苗载体释放系统亦具有无需纯化抗原,无需佐剂,可避免抗原在胃内的降解和变性等优点。大量试验证实,减毒伤寒沙门菌作为疫苗免疫载体接种人体是安全的,具有广阔的实际应用价值。 中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)为新近发现的H. pylori主要毒力因子之一。目前对HP-NAP的免疫原性及保护性研究尚处于起步阶段。本研究旨在将HP-NAP基因克隆入真核表达载体pIRES,然后将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建HP-NAP口服重组DNA疫苗,并探讨其免疫原性,为多价抗H. pylori核酸疫苗的后继研究奠定基础。 二、研究目的 构建HP-NAP活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,评价其免疫治疗作用。 三、研究内容 第一部分 以H. pylori基因组DNA为模板,引物NPF:5′-GTC CTC GAG ATG AAA ACA TTT GAA ATT TTA AAA CAT TTG CAA GCG-3′,含XhoⅠ酶切位点;NPR:5′-GTC ACG CGT TTA AGC CAA ATG GGC TTG CAA CAT CC-3′,含MluⅠ酶切 WP=9 位点,PCR扩增napA(435 bp)基因全长序列,回收PCR产物,克隆入T载体pBT,构建重组质粒pBT-napA,酶切鉴定。 以XhoⅠ、MluⅠ分别酶切重组质粒pBT-napA及真核表达载体pIRES,回收目的片段,连接并转化,得到pIRES-napA,酶切鉴定。ANTHEPROT V5.0软件分析napA表达蛋白质的生物学特性,DNAStar-Protean? V5.0软件预测其二级结构。 将pIRES-napA转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000甲基化修饰,筛选抗性菌落,选择性扩增,碱裂解法小量抽提质粒,进一步电击转化终宿主菌SL7207,PCR及双酶切鉴定。 第二部分 制作SS1长期感染小鼠模型,30周后取15只随机等分为3组,治疗组予109 cfu/0.4ml疫苗菌灌胃,每周1次,连续3周;对照组分别予等量生理盐水或转化pIRES终宿主菌。末次免疫4周后处死小鼠,剪取部分胃窦组织行快速尿素酶试验,ELISA检测血清抗体滴度。 四、研究结果 第一部分 PCR自H. pylori基因组DNA中扩增出一约435 bp产物。重组质粒pBT-napA经Xho I /Mlu I双酶切,获得一约435 bp片段。 BLAST分析表明,本实验所克隆napA序列与H. pylori SS1株napA核苷酸的同源性为98%(427/435),蛋白质的同源性为98%(142/144)。 重组质粒pIRES-napA经相应双酶切后,获得一约435 bp片段;以pIRES-napA为模板,NPF及NPR为引物,PCR亦扩增出一约435 bp片段,表明重组质粒构建成功。ANTHEPROT及DNAStar-Protean?预测napA表达蛋白质的分子量约为17 000 u,具有良好的抗原性。 重组质粒pIRES-napA成功转化SL7207,扩增60代后未见质粒丢失。以抽提质粒为模板,NPF、NPR为引物,PCR扩增出约435 bp目的基因;Xho I/Mlu I双酶切亦可见线性化载体片段和目的基因。表明HP-NAP口服重组DNA疫苗菌构建成功。 WP=10 第二部分 长期感染SS1小鼠口服接种重组 DNA疫苗菌SL7207-pIRES-napA后耐受良好,未见明显腹泻。免疫后4周快速尿素酶试验结果显示治疗组75%(3/4)阴性,优于对照组(0/5,P=0.048),ELISA结果亦显示免疫接种后相应抗体滴度明显升高。显示所构建口服重组DNA疫苗具有良好的免疫原性。 五、研究结论 成功构建了具良好免疫治疗作用的HP-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗H. pylori DNA疫苗奠定了基础。


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