应用基因芯片技术对Graves病、甲状腺乳头状癌相关基因表达的研究

【摘要】：研究目的及实验设计 Graves病(Graves disease，GD)是引起甲状腺功能亢进最常见的原因(约占90％)。它是一种器官特异性自身免疫病，其发病受到遗传、环境、免疫等多种因素的影响。而甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma，PTC)是最常见的原发性甲状腺癌，占所有甲状腺癌的60—80％。由于疾病的复杂性，以往对上述两种疾病发病机制的研究尚无明确定论，需要用新的技术手段来阐明。 基因芯片技术(gene chip technology)，又称cDNA微阵列技术(cDNA microarray technology)，可同时检测成百上千个基因的表达。自从九十年代初美国Affymetrix公司Fodor等首先开展基因芯片技术以来，该技术已被成功地应用于基因功能研究的各个领域，进行的大规模基因表达已成为研究病理生理过程的卓有成效的研究方法。但目前有关基因芯片技术研究Graves病及甲状腺乳头状癌发病机制的报道较少。应用该技术寻找上述疾病差异表达的基因，将有助于进一步阐明其发病机制，并为诊断和治疗上述疾病提供新的策略。为此我们进行了以下研究，用基因芯片技术筛选GD、PTC相关基因，并用RT-PCR、免疫组织化学的方法对部分基因进行验证。实验包括以下四部分：1)基因芯片筛选Graves病免疫相关基因；2)RT-PCR、免疫组织化学验证Graves病差异表达基因；3)基因芯片筛选甲状腺乳头状癌相关基因；4)RT-PCR、免疫组织化学验证甲状腺乳头状癌差异表达基因。 本课题的主要方法和结果 第一部分、基因芯片筛选Graves病免疫相关基因 方法：收集Graves病患者手术切除标本3例，均为女性，年龄41—46岁。术前经抗甲状腺药物准备达到症状控制，T3、T4正常，并加服复方碘溶液2周。诊断均经临床及病理证实。正常对照3例，取自甲状腺腺瘤患者瘤旁2cm外正常甲状腺组织。所有组织离体后均快速液氮保存。将上述2组(GD组、对照组)甲状腺组织的总RNA提取后，分别逆转录成cDNA，掺入荧光标记，与型号为 鑫三矍医大学博士学位论文 中文摘要 BiostarH一IC的人免疫相关芯片(含578条靶基因)杂交，经过洗片、信号检测、 微阵列图像分析、计算机软件数据处理，将所得的数据进行比较，得到二者间 基因表达的差异信息。结果:在进入研究的578条基因中，80条基因有差异表 达，其中表达增加的基因有31条(2.0倍以上)，表达降低的基因有49条(0.5 倍以下)，涉及细胞因子及其受体、粘附分子、补体、信号转导子转录激活子l (ST/钉，1)、过氧化氢酶、骨形态发生蛋白7(BMP7)及其受体、Toll样受体、 原癌基因等许多方面。 第二部分、l石卜PCR、免疫组织化学验证GraveS病差异表达基因 方法:收集GraveS病患者手术切除标本共13例，其中男性5例，女性8 例，年龄33一54岁。术前经抗甲状腺药物准备达到症状控制，T3、T4正常，并 加服复方碘溶液2周。13例正常对照组织取自甲状腺腺瘤瘤旁Zcm甲状腺组织。 诊断均经临床及病理证实。所有组织离体后分为两份，一份快速液氮保存用于 RFPCR实验，设计并合成SJ谈Jl、BMP7、p一actin引物，抽提甲状腺组织总 RNA，RT-PCR半定量检测S工气Tl、BMP加RNA表达量;另一份于10%的中性 甲醛溶液中固定，行S工Al，1、BMP7免疫组化染色，AxioskopZ plus显微镜及图 像分析系统分析S丁沪门，1、BMP7蛋白显色强度，计算阳性率、强阳性率。结果: IU卜PCR实验显示51人Tl的表达水平在GD组均高于对照组，而BMP7表达水平 在GD组均低于对照组，结果与基因表达谱芯片结果吻合。免疫组化显示GD组 甲状腺组织滤泡增生，滤泡大小不等。STAfl大量沉积在GD甲状腺滤泡细胞 胞浆中，呈棕黄色，而正常对照组未见STATI的表达。与之相反BMP7仅在正 常对照组中有表达，棕黄色阳性染色物也位于胞浆。其表达的阳性率及强阳性 率经统计学分析认为具有显著性差异。 第三部分、基因芯片筛选甲状腺乳头状癌相关基因 方法:3例PTC组织，男性1名，女性2名，年龄35一43岁。经病理证实 为甲状腺乳头状癌，未发现有淋巴结转移。正常对照取自甲状腺腺瘤患者瘤旁 Zcm外正常甲状腺组织。所有组织离体后均快速液氮保存。将上述2组(PTC 组、对照组)甲状腺组织的总RNA提取后，分别逆转录成cDNA，掺入荧光标 记，与型号为BiostarH一I的人基因表达谱芯片(含1 152条靶基因)杂交，经过 信号扫描，微阵列图像分析，计算机软件处理数据，得到二者间基因表达的差 异信息。结果:在进入研究的1152条基因中，65条基因有差异表达，其中表达 鑫茎医大学博士学位论文 中‘义摘要 增加的基因有48条(2.0倍以上)，表达降低的基因有17条(0.5倍以下)，涉 及错配修复基因、细胞外基质相关蛋白、组织型金属蛋白酶抑制物l(TIMPI)、 蛋白激酶、细胞因子及其受体、转化生长因子日受体I(TGF p Rl)、细胞信号 转导、细胞周期、ras相关蛋白基因、人血红蛋白基因、人白细胞抗原基因等。 第四部分、RpPCR、免疫组织化学验证甲状腺乳头状癌差异表达基因 方法:收集PTC患者手术切除标本共11例，其中男性4例，女性7例，年 龄33一60岁。经病理证实为甲状腺乳头状癌，仅1例女性患者发现有颈部淋巴 结转移，无远处转移。11例对?