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表皮干细胞的体表分布及其分离、培养和鉴定

牛云飞  
【摘要】:一、研究背景 人体皮肤的自我更新主要依靠表皮基底层内存在的表皮干细胞分裂、增殖、 分化来完成。皮肤中表皮干细胞数量较少,但其具有强大的增殖能力,在皮肤更 新、伤口愈合、肿瘤形成以及维持皮肤内环境的稳定等方面发挥着重要作用。临 床工作中发现:严重烧伤、创伤所致的皮肤损伤,不同部位皮肤创面的愈合能力 不完全相同,且随着年龄增大,创面的愈合能力逐渐降低,如深Ⅱ°烧伤创面, 小儿的愈合能力明显强于老年人,创面上皮化的速度较老年人快,产生这种现象 的原因涉及多个方面,其中表皮干细胞数量、位置及增殖分化潜能的差异可能是 其重要原因之一。研究发现:皮肤基底层表皮干细胞数量随着年龄增大而逐渐减 少,新生儿及少儿皮肤基底层表皮干细胞数量明显多于成年人。人体不同部位皮 肤表皮干细胞分布是否也存在差异,目前研究尚不清楚,这一问题的研究对于充 分认识皮肤发育、分化、修复机制有重要意义。大面积烧、创伤所致皮肤损伤的 治疗,最主要的问题是尽快封闭创面,由于自体皮来源有限,组织工程化皮肤的 研究一直是当前研究的热点,目前尚无特别有效的皮肤替代物应用于临床。已经 研制出的活性人工皮肤多是以可降解性材料为支架,接种成纤维细胞或表皮细胞 构建而成,存在细胞代谢活性不稳定,接种的细胞易衰老、凋亡等问题,影响了 其广泛应用。若能分离富集出大量表皮干细胞并加以诱导、调控,可为构建组织 工程化皮肤提供大量增殖能力较强的种子细胞。表皮干细胞有着广泛的应用前 景,研究其生长分化规律及调控机制,对于创面愈合机制、皮肤组织工程、肿瘤 发生及基因治疗的研究具有重大促进作用。 二、研究目的 1.研究人体不同部位皮肤表皮干细胞的分布差异,为烧伤病人手术植皮及 体外分离培养表皮干细胞时选择供皮区提供依据; 2.研究表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定方法,观察离体状态下表皮干 细胞的生长特性,为表皮干细胞的分离培养及组织工程化皮肤的研究提供细胞学 基础。 - 2 - WP=7 第二军医大学 中文接要 硕士学位论文 三、研究方法 第一部分 表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异 分别从 5 例 18-45 岁成年男性志愿者身体取头部、胸部、背部、臀部、大腿 内侧、大腿外侧、上臂内侧、上臂外侧、手掌、足底、包皮及阴囊皮肤标本,取 材后立即用 10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4℃保存待测。所有标本经 系列切片后,分别采用鼠抗人角蛋白 19 (keratin19,K19)和整合素β1(integrin β1)单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学 EnVision 法检测皮肤组织中表皮干 细胞标志物角蛋白 19 和整合素β1 的表达,200 倍光镜下观察免疫组化结果,照 相后随机选取 20 个视野,每视野连续观察 100 个基底细胞,记录阳性细胞数并 计算出阳性率,以 SPSS 软件分析不同部位皮肤表皮基底层中角蛋白 19 和整合 素β1 阳性细胞率的差异。 第二部分 表皮干细胞的分离、培养、鉴定及生长特性观察 无菌条件下取包皮环切术后的新鲜包皮,采用 DispaseⅡ酶和胰蛋白酶二步 法分离表皮细胞,Ⅳ型胶原粘附法将表皮细胞分为 10 min 粘附组和 24 h 粘附组, 粘附细胞计算贴壁率后,一部分即刻消化,分别以转录因子 p63 和角蛋白 19 单 克隆抗体标记后行流式细胞仪检测,比较两组细胞标记率的差异;一部分继续培 养,定期观察,计算克隆形成率。分别于第 1、3、5、7 天取出 10 min 粘附组六 孔板内的盖玻片,采用免疫组织化学 EnVision 法检测 10 min 粘附组细胞转录因 子 p63 和角蛋白 19 的表达特征。 四 研究结果: 第一部分 光镜下可见角蛋白 19 和整合素β1 在不同部位皮肤组织中的表达具有相似 性,头皮的毛囊隆突部及皮下腺管可见较多的 K19 和整合素β1 阳性细胞,毛囊 间的表皮基底层表达较少;手掌、足底等无毛皮肤中阳性细胞主要位于皮下腺管, 皮肤基底层基本不表达;其它部位阳性细胞主要位于表皮基底层,呈散在非均一 分布,于钉突部位相对集中,不同部位皮肤钉突的数量存在明显差别,包皮及阴 囊皮肤基底层可见较多的钉突及 K19 和整合素β1 阳性细胞。统计分析表明:皮 肤基底层阳性细胞以包皮及阴囊最多,其次是臀部;背部多于胸部,四肢近端外 - 3 - WP=8 第二军医大学 中文接要 硕士学位论文 侧多于四肢近端内侧;背部、大腿外侧、上臂外侧没有明显差异,胸部、上臂内 侧、大腿内侧没有明显差异;头皮、手掌及足底皮肤基底层阳性细胞数量最少, 但在毛囊隆突部及皮下腺管,可见较多的 K19 和整合素β1 阳性细胞。 第二部分 Ⅳ型胶原包被的培养皿中,10 min 粘附组与 24 h 粘附组贴壁率和克隆形成 率有显著差异,P0.05。10 min 快速粘附组贴壁率只有 8.95±1.42%,但克隆形 成率为 29.26±2.2%,明显高于对照组。以 K19 和 p63 单克隆抗体标记 10 min 快速粘附细胞和 24 h 粘附细胞后经流式细胞仪分选,10 min 快速粘附组标记率 明显高于对照组,组间存在显著差异,P0.05。光镜下观察,10 min 快速粘附组 显示出更强的分裂增殖能力,形成的克隆较大,克隆中细胞数多在 32 以上。免 疫组织化学检测发现:10 min 快速粘附细胞主要为


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