冻融抗原冲击致敏的树突状细胞诱导产生肺癌特异性免疫应答的实验研究

【摘要】：据 1996 年世界卫生组织(WHO)报告,肺癌居各类恶性肿瘤死亡率首位。美国 2001 年统计肺癌占当年所有癌症死亡率的 25%及新发癌症病例的 13%。1998 年上海市 恶性肿瘤流行病学调查显示,男性和女性肺癌发病率达到 52.6/10 万和 18.2/10 万,分别 占第一和第三位。近几十年来在肺癌预防和治疗领域各国均进行了深入研究,但传统的 治疗的手段仍为手术,化疗和放射治疗。尽管部分患者能通过这些疗法得到一定程度的 治疗,但其缺陷仍十分明显,从总体情况看肺癌的治愈率仍较低,鉴于此,研究和发现 新的治疗方法十分必要。 生物疗法的发展给肿瘤治疗带来了新的希望,在众多肿瘤的生物疗法中,免疫治 疗由于能发挥患者机体自主的抗肿瘤免疫功能而备受重视,也最有希望。近年来,随着 多种学科的交叉渗透,免疫学研究取得了重要进展,其中最突出的进展是对体内抗原递 呈细胞(APC)研究有了深入认识。机体能对抗原异物(包括肿瘤抗原)产生免疫反应 以清除这些抗原,必须通过 APC 去识别、加工、处理并将此信息提供给体内的效应细 胞,因此,APC 在体内的免疫应答过程中处于极其关键的环节。以往对于哪些细胞是 APC,哪些 APC 作用最关键一直存在模糊认识,这导致了肿瘤免疫和免疫治疗研究难 以取得突破。近年来,对树突状细胞(DCs)研究的深入不仅使基础免疫研究取得重要 进展,而且给肿瘤的免疫治疗带来了希望。树突状细胞是目前发现的最强的抗原递呈细 胞,具有诱导初始免疫应答和免疫记忆应答的能力。以 DCs 为基础的肿瘤疫苗研制更成 为目前研究热点之一。现有制备 DCs 肿瘤疫苗的方法很多,包括:体外肿瘤抗原直接致 敏或肿瘤抗原肽基因修饰的树突状细胞疫苗;肿瘤细胞与树突状细胞融合疫苗等,这些 DCs 疫苗各有特色并陆续在临床治疗中得到应用。最新临床研究显示 DCs 肿瘤疫苗在 治疗黑色素瘤,B-cell 淋巴瘤,多发性骨髓瘤,肾癌,前列腺癌等肿瘤方面具有良好的 临床效果。可惜的是肺癌至今未发现特异性肿瘤抗原,现有的抗原成分免疫原性低,所 以相关基础与临床研究较少。本实验试图采用一些简便,安全及有效的方法对此开展研 究,并希望能验证该方法具有一定的临床应用价值。考虑肺癌至今没有明确的肿瘤特异 性抗原,我们采用全部肿瘤细胞的抗原负载树突状细胞;因为已证明树突状细胞可以有 第 3 页 WP=8 第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 效地吞噬各种形式的细胞裂解物,国外几所研究中心在临床治疗中应用新鲜肿瘤标本或 已建系的肿瘤细胞裂解物负载病人的树突状细胞,在体外已经成功诱导出黑色素瘤,前 列腺癌,肾癌等多种肿瘤的抗原特异性 CTL,并在随后的临床治疗中观察到明显的抗肿 瘤保护现象,而且未见明显的副作用。我们力图通过体内和体外实验证实肺癌细胞裂解 物作为抗原来源刺激树突状细胞治疗人肺癌是安全、可行的。为加强疗效我们在国内首 次将新型热休克蛋白 Hsp70L1 应用于肺癌治疗领域并验证了其免疫增强效果。此次试验 结果使我们相信以树突状细胞为基础的肺癌疫苗可以成为临床治疗肺癌的另一种选择。 本课题主要研究方法: 一、体外树突状细胞的分离培养和鉴定: 利用梯度离心法从已鉴定为HLA-A2阳性的正常健康志愿者抗凝外周血中分离出单 个核细胞 (PBMC),用 10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养基培养,放置 37℃ , 5%CO2 孵箱内培养过夜。第 2 天吸去非粘附细胞,获得粘附细胞,按rhGM-CSF1000U/ml,rhIL-4 500U/ml终浓度加入细胞因子,培养 7 天。第 7 天收集细胞,台盼蓝染色,记数,显微 镜观察细胞形态。同时与肺癌A549 细胞冻融抗原共孵育一天完成冲击致敏。在加入抗 原成分时另设试验组加入新型热休克蛋白Hsp70L1 作为佐剂。DCs成熟前后即培养第 6 天和第 8 天通过形态学、细胞表型及特异性细胞因子的分泌这三个方面进行鉴定,验证 PBMC加细胞因子培养的树突状细胞的方法是否有效,树突状细胞能否成熟。 二、 体外肿瘤特异性细胞毒 T 细胞的分离培养和鉴定,以及肿瘤杀伤效果的 评价 1. T 细胞分离和培养 同一志愿者抗凝外周血,经梯度离心收获的外周血单个核细胞 (PBMC)在过夜培养 后,收获非贴壁细胞,用 RPMI 1640 完全培养基置 37℃ , 5%CO2 孵箱内继续培养,并 按 IL-2 20U/ml 终浓度加入细胞因子。24h 后换半量培养基 (含 IL-2 20U/ml);以后 2~3 天半量换液 1 次。培养 9 天,收集细胞,计数后与被肿瘤抗原冲击后的 DCs 以 20 :1 的 比例混合培养,24h 后换半量完全培养基 (含 IL-2 100U/ml),隔日半量换液 1 次。培养 7 天后再用负载肿瘤抗原的 DCs 刺激一次,第二次刺激后继续培养 7 天,收集的细胞即 为 CTL 细胞。 第 4 页 WP=9 第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 2. 细胞因子分析 DCs 再刺激 24 小时后,收集培养上清液,用 ELISA 法检测 IL-2, IFN-γ 和 IL-10 的浓度,观察是否有 Th1 型细胞因子的分泌。 3.同种混合淋巴细胞反应 检测 DCs 诱导同种自体 T 细胞增殖能力:梯度离心法分离的 PBMC 在去除红细胞 后得到非贴壁细胞(大部分为 T 和 B 细胞)作为反应细胞。未