收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

腺病毒介导的siRNA抑制hTERT增强肝癌化疗敏感性的实验研究

王维锋  
【摘要】:肝癌是全球常见10种恶性肿瘤之一,全球每年约有25万人死于肝癌,我国约占其中40%,还呈逐年上升之势。在以手术切除为主的肝癌综合治疗方案中,化疗是不可缺少的一环。因为肝癌较其他实体肿瘤对化疗更不敏感,所以化疗总体效果不明显。因此,研究提高肝癌细胞对化疗的敏感性,是提高病人生存率的重要策略。 端粒酶是一种逆转录酶,由RNA模板(hTR)和蛋白催化亚基(hTERT)组成,可以合成端粒维持基因组稳定性。其中RNA模板(hTR)为组成性表达,端粒酶活性和蛋白催化亚基(hTERT)的表达呈正相关。研究证实通过端粒酶延长端粒维持基因组稳定性是绝大部分肿瘤细胞逃避凋亡无限增殖所必需的。在本室以前进行的肝癌端粒酶相关研究中,也发现肝癌的端粒酶阳性率为85%,明显高于癌旁组织、肝硬变组织及慢性肝炎组织,而正常肝脏组织没有端粒酶活性,我们认为端粒酶的表达可能在肝癌的发生发展中起到了重要作用。研究者希望通过使用反义核酸特异抑制端粒酶活性治疗肿瘤。但是反义抑制的效率低下,如何寻找一种高效安全的抑制方法成为以端粒酶为靶点肿瘤治疗研究首先要解决的问题。 RNAi是近两年来发现的一种细胞固有的基因沉默的机制。外源或内源的双链(dsRNA)可以触发靶基因转录的同源序列mRNA特异性地降解,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转最后基因沉默机制(posttranscriptional gene silienceing,PTGS)。通过细胞内一系列酶的作用,极少的dsRNA就能特异高效的抑制靶基因。腺病毒载体系统感染宿主细胞的范围广泛,对分裂期和非分裂期细胞均可感染,感染效率高,病毒感染过程中不整合到宿主细胞的基因组中,不会引起宿主细胞的插入突变,遗传学稳定性高,可获得比较高的病毒滴度。 我们利用腺病毒的高感染率和RNAi的高抑制率使细胞的端粒酶活性抑制,然后应用细胞及分子生物学技术,观察端粒酶抑制后细胞生长变化及对化疗敏感性的变化。 本实验主要有三部分组成: 第二军医大学 硕士论文 1.表达si/hTERT腺病毒载体的构建及制备 本实验研究利用pSUPER一EGFP载体与pAd一Easy系统构建了RNA干扰端粒 酶腺病毒载体,命名为Ad一si爪TERT。把化学合成的寡聚核普酸连入用Bgln+Hind 111酶切的pSUpER一EGFp载体,命名为pSUpER一51爪TERT。将pSUpER一51小TERT 用EeoRI+Hind 111酶切,回收目的片段与用EcoRI+Hind 111双酶切后pCDNA3.1+ 载体片段连接。再经Hind工H+X ba工双酶切鉴定正确后,将回收含有目的基因 片段与用HindH工+Xba工双酶切后的TRACK载体片段连接,构建成 TRACK一si/hTERT质粒。经Pmel酶切后与Ad一Easy同源重组,重组质粒用Pacl 酶切,转入293细胞内包装扩增,经氯化艳梯度离心后,获得10’“PuF/ml病毒 滴度的病毒悬液,一80℃冻存待用。 2.Ad一s盯hTERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体外实验研究 本实验主要验证Ad一si爪TERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体外作用。通 过荧光显微镜观察发现腺病毒可高效感染肝癌细胞株7721。经R丁’- pCR、Westem blot、银染一TRAP等方法证实,腺病毒Ad一si爪TERT可有效的抑制肝癌细胞株 7721中端粒酶的表达及活性。但测定端粒酶抑制后短期内细胞的生长曲线没有 太大变化且凋亡率不高。用MT’T法和流式细胞仪观察到顺铂对肝癌细胞株7721 的生长阻滞作用非常明显,但无明显凋亡。进一步的实验证实,经Ad一si小TERT 腺病毒抑制肝癌细胞株7721的端粒酶活性后,用顺铂化疗可出现大量凋亡;而 对照组的凋亡却不明显。实验结果说明,通过Ad一si爪TERI,腺病毒能在体外增强 肝癌细胞化疗敏感性。 3.Ad一s盯hTERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体内实验研究 上述实验证实,经Ad一si小TERT腺病毒感染的肝癌细胞株7721对顺铂化疗 的敏感性明显增强。进而进行动物实验,在BALB/C小鼠上接种7721肝癌细胞 成瘤,可观察Ad一si爪TERT腺病毒联合顺铂化疗的疗效。我们将实验组肿瘤生长 曲线与未处理,Ad一si小TERT腺病毒处理,顺铂处理对照组对比后发现,实验组 肿瘤的体积增长比对照组明显要慢。,经可重复测量的双因素方差分析表明差异显 著。从组织切片HE染色也能看出实验组有明显的坏死而对照组没有。实验结果 说明,Ad一si爪TERT腺病毒能在体内增强肝癌细胞化疗敏感性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 卢斌;吴鸿;蔡在龙;邹大进;;大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年37期
2 陈青;娄文加;钱程;刘立;;RNA干扰抑制COX-2的重组腺病毒的构建及体外抗肿瘤活性[J];浙江理工大学学报;2010年02期
3 姜晓兵;刘如恩;张方成;赵洪洋;朱贤立;;腺病毒载体介导的Polo样激酶1短发夹环RNA对胶质瘤体内外增殖的抑制作用[J];中华实验外科杂志;2006年12期
4 宇汝胜;钱海鑫;汪泳;;重组腺病毒介导siRNA抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达[J];苏州大学学报(医学版);2008年04期
5 张沁丽;秦新月;殷成;彭彦;;编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定[J];第四军医大学学报;2008年01期
6 李婉宜;李明远;肖丽英;张朝良;刘豫蓉;李小玉;张思源;李燕;;hTR-siRNA腺病毒对裸鼠人宫颈癌移植瘤的治疗作用[J];四川大学学报(医学版);2008年05期
7 郭彩霞;李艳博;孙婷;杨巍;孙志伟;龚守良;;靶向乏氧诱导因子-1α和生存素基因的RNA干扰腺病毒穿梭载体的构建[J];中国现代医学杂志;2009年20期
8 高明勇;肖建德;李振宇;闫洪印;余铮;田长庆;陈扬;顾洪生;;RNA干扰应用于抑制脊髓损伤急性期白细胞介素6受体表达的实验(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年32期
9 褚衍六;赵幼安;顾晓萌;宋现让;杨艳;;腺病毒介导siRNA抑制人胃腺癌细胞VEGF表达[J];山东大学学报(医学版);2006年02期
10 韦永琼;曾照芳;陈力学;;构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体[J];南方医科大学学报;2009年12期
11 李绍祥;张艳霞;张成平;胡学玲;李娟;姚鹏;胡大荣;;Ad/rAAV杂合体病毒介导抗HBV shRNA表达框定点整合研究[J];中国现代医学杂志;2010年21期
12 林展翼;林曙光;;小发夹核糖核酸沉默鼠孤束核血管紧张素Ⅱ受体mRNA表达[J];岭南心血管病杂志;2008年02期
13 童天朗;梅炯;;腺病毒介导VEGF-siRNA抑制骨肉瘤组织中VEGF表达的实验研究[J];同济大学学报(医学版);2007年02期
14 李绍祥;张艳霞;张成平;姚鹏;李娟;胡大荣;;腺病毒/重组腺相关病毒杂合体病毒的构建[J];实用医学杂志;2010年08期
15 林展翼;林曙光;;血管紧张素Ⅱ 1型受体亚型鉴别的RNAi应用研究[J];广东医学;2008年07期
16 张巍巍;郭晓钟;;胰腺癌的基因治疗[J];国际消化病杂志;2005年06期
17 王春毅;傅仲学;;RNA干扰技术在肿瘤基因治疗方面的研究进展[J];国际外科学杂志;2006年01期
18 魏云杰;江洪;陈静;张静;徐昌武;;CBP基因沉默抑制血管平滑肌细胞增殖的研究[J];海南医学院学报;2011年04期
19 祝源;邹安琪;;胶质瘤的基因治疗[J];中国肿瘤;2006年11期
20 彭亮;刘志华;钟诚;丁振华;惠长野;曹虹;;shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用[J];中国公共卫生;2010年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 贾红梅;;腺病毒AV127株在非免疫鸭胚中增殖规律的研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
2 谭江琳;彭旭;袁顺宗;马兵;张小容;罗高兴;吴军;;人P311腺病毒表达载体的构建及表达[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
3 宋智琦;;MAP_2基因转染抑制恶性黑色素瘤细胞生长的研究[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年
4 郑晓群;华科;彭颖;黄燕燕;杨军军;李宝青;;婴幼儿腹泻标本中腺病毒的检测及分型[A];2008年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2008年
5 路秀英;杨贵贞;;应用噬菌体展示短肽探索腺病毒表位[A];第七届中国抗炎免疫药理学术会议论文摘要集[C];2000年
6 张辉;于力;朱龙英;万延慧;朱为民;;Hair-pin RNA介导的番茄抗TYLCV效果初步研究[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
7 牛建强;夏咸柱;扈荣良;张守峰;黄耕;;应用细菌分子间同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
8 王永志;扈荣良;王莘;张守峰;李海涛;肖跃强;夏咸柱;;狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬-2型腺病毒构建及免疫研究[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
9 李艳;严明;;RNA干扰[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
10 闫虎斌;陆智明;;基于RNA干扰的植物抗病毒育种原理及研究进展[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王颖;Toll样受体4基因干预抑制动脉粥样硬化的机制研究[D];山东大学;2007年
2 徐建国;携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒对结肠癌的治疗作用[D];第二军医大学;2003年
3 李恭会;shRNA阻抑前列腺癌细胞雄激素受体和hTERT基因表达的研究[D];浙江大学;2005年
4 郭明高;表面抗体基因在肝移植中抑制乙型肝炎病毒再感染的实验研究[D];第二军医大学;2005年
5 魏军民;RNA干扰逆转肿瘤多药耐药的实验研究[D];山东大学;2005年
6 陈雄;携带内皮抑素基因增殖型腺病毒治疗卵巢癌的实验研究[D];第二军医大学;2006年
7 王晓龙;小鼠骨骼肌细胞SelW基因的RNA干扰研究[D];东北林业大学;2006年
8 王静;转化生长因子-β1基因沉默对人涎腺粘液表皮样癌Ms细胞生物学行为的影响[D];第四军医大学;2006年
9 张守峰;狂犬病病毒的RNA干扰研究[D];吉林大学;2007年
10 王鹏雁;口蹄疫病毒干扰RNA转基因小鼠模型的构建[D];石河子大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李敏然;腺病毒介导HBV载体表达双靶位shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV表达的研究[D];河北医科大学;2007年
2 李忠远;腺病毒载体介导shRNAs抑制大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5基因表达的研究[D];华中科技大学;2007年
3 彭思扬;XAGE-1b腺病毒干扰载体的构建及其功能研究与一种fiber缺失型重组腺病毒系统的构建[D];复旦大学;2009年
4 王维锋;腺病毒介导的siRNA抑制hTERT增强肝癌化疗敏感性的实验研究[D];第二军医大学;2004年
5 黄伟素;水稻穗颈伸长基因EU12的功能验证[D];浙江大学;2006年
6 贾勇圣;红霉素抑制成神经细胞瘤增殖机制的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
7 姚津剑;针对P基因的siRNA对HBV表达影响的实验研究[D];华中科技大学;2007年
8 李涛;抑制乳腺癌耐药蛋白表达逆转肝细胞癌多药耐药[D];重庆医科大学;2009年
9 李永强;P14ARF、P53基因表达与E1B-55KD缺陷型腺病毒治疗恶性肿瘤疗效关系研究[D];广西医科大学;2003年
10 孙钢;Nm23-H1cDNA片段克隆及腺病毒载体的构建[D];昆明医学院;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者  邱曙东;上海聚焦“科技小巨人”[N];解放日报;2006年
2 新讯;“胖病毒”可能是肥胖元凶[N];医药经济报;2007年
3 ;瑞士科学家发现病毒侵入细胞的过程[N];中国高新技术产业导报;2001年
4 张建中;肥胖之因也许是病毒[N];健康报;2000年
5 徐铮奎;美国闹流感 全球打喷嚏[N];医药经济报;2008年
6 ;几种呼吸道病毒性疾病表现[N];中国医药报;2006年
7 庄北宁;神秘变异感冒病毒,在美夺10命[N];新华每日电讯;2007年
8 小文;默克公司艾滋病疫苗可能增加感染HIV风险[N];中国医药报;2007年
9 记者 陈威华;病毒侵入细胞的过程已查明[N];新华每日电讯;2001年
10 欣华;肥胖可能由病毒引起并会传染[N];医药经济报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978