重组人干扰素α长效注射微球的研究

【摘要】：干扰素α(Interferon-α,IFN-α)具有广泛的抗病毒、抗增殖和调节免疫机 能等生物学活性。在临床上广泛用于治疗各种病毒性疾病和多种恶性肿瘤,其中 对慢性乙肝、丙肝、巨细胞病毒感染、血源性恶性肿瘤疗效确切。常规给药方式 为肌注或皮下注射,但其生物半衰期短(5-7h),常需频繁注射给药,给病人用 药带来很大的不便。本课题设计采用体内可生物降解的高分子材料聚乳酸羟基乙 酸嵌段共聚物(PLGA)将 IFN-α包被成微球,通过微球内部的孔道以及高分子 材料的融蚀降解来调控 IFN-α在体内外的释放, 以期达到一次给药后 4 周持续 释放药物的长效缓释效果,从而提高用药质量和病人用药的顺应性。 课题工作首先研究了复乳法(w/o/w)制备 IFN-αPLGA 微球的制备工艺及其 影响因素。通过单因素实验设计考察了制备复乳时的搅拌速度、外水相聚乙烯醇 (PVA)浓度、油相 PLGA 浓度、内水相渗透压以及 PLGA 的平均分子量等因素对 微球形态、平均粒径和包封率的影响。结果表明制备复乳时的搅拌速度、PVA 浓 度、PLGA 浓度、内水相渗透压和缓冲系统都对微球的外观和粒径有显著影响。 微球形态和粒径是微球释药调控的重要因素,微球粒径越小,突释效应越明显。 IFN-α的包封率通常较高(80%以上),在试验条件下除 PLGA 浓度、PVA 浓度对 包封率影响较大以外,各因素对于包封率的影响不显著。试验中还发现内水相的 渗透压可以显著的影响微球的粒径、外观以及释药特性。内水相脱盐后,可使制 备的微球粒径和数目减小,密度增大,突释效应显著降低。 文献报道复乳法制备微球的影响因素较多,且由于制备过程中形成了油水界 面,易导致蛋白质失活。因而本试验进一步研究了固体/油/油法(s/o/o)制备 IFN-αPLGA 微球的处方及制备工艺。试验中首先制备了 Zn2+与 IFN-α复合物, 并证明了 Zn2+与 IFN-α复合物是一种可溶性沉淀,溶解后在电泳和凝胶色谱上的 行为与 IFN-α原液一致。根据文献报道采用相凝聚法成功地制备了 IFN-α及其 Zn2+复合物的微粉,并将其包被成微球。通过单因素实验考察了 PLGA 浓度、搅拌 速度、IFN 微粉粒径、油相中的添加剂等因素对微球粒径、外观以及包封率的影 响。试验中发现 PLGA 浓度、搅拌速度以及甘露醇等添加剂对微球粒径和外观影 响显著。由于蛋白质在外油相中不溶解,因而包封率通常较高(90%以上)。IFN -α经 Zn2+处理形成复合物、油相中加入甘露醇、伯洛沙姆 188(F-68)等添加 剂则可显著地改变微球的释药特性,尤其对突释效应影响显著。 以 BCA(Bicinchoninic acid,二喹啉甲酸)分析法测定了释放介质中 IFN -α的浓度,考察了微球的体外释放特性。体外释放试验表明微球具有显著的长 效作用,可以缓慢释放药物 30 天左右。用平均分子量为 34,000 的 PLGA 制备的 1 WP=6 中英文摘要 微球,与文献报道一致,微球的体外释放曲线可以分为三相:速释相、时滞相和 缓释相。但时滞相较长,缓释相累积释放较少,微球的处方和制备工艺对于微球 的速释相影响显著,对于时滞相和缓释相影响较小。而用 PLGA 平均分子量为 14,000的PLGA制备的微球时滞相则不明显,缓释相的累积释放达到了50%左右, 说明 PLGA 的平均分子量是微球体外释放时滞相和缓释相的主要影响因素。处方 工艺优化后用复乳法和固体/油/油法(s/o/o)制备的 PLGA 微球突释效应控制在 了 10%左右,累积释放在 60%左右,体外释药均符合零级释放方程。 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分子排阻色谱以及细 胞病变抑制法(CPE)等方法考察了制备工艺和释放过程中 IFN-α的稳定性。 试验表明 IFN-α溶液在 37℃条件下放置一个月可形成少量聚集产物和降解产 物。复乳法制备工艺对 IFN-α的稳定性影响较小,微球中的 IFN-α比活性较高, 但在微球的体外释放过程中 IFN-α的比活性明显下降。用 s/o/o 法制备的 IFN -α和 Zn2+复合物微球中的 IFN-α比活性较低,SDS-PAGE 试验也表明微球中的 复合物用 EDTA 溶解后仍有少量二聚体产生,可能与 IFN 和 Zn2+复合物本身溶解 性较差和制备微粉的冷冻干燥过程中未加保护剂有关。 结论:采用可生物降解的聚合物 PLGA 作为载体材料,可以将 IFN-α制备成 缓释一个月的微球注射剂,该制剂应用前景广阔。