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人IL-24的重组表达、纯化及其对人树突状细胞的功能调控

卢琳  
【摘要】:白细胞介素24(Interleukin-24,IL-24)原先被命名为黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation-associated gene 7,mda-7),是1995年由美国哥伦比亚大学的Jiang等人发现的一种新型细胞因子。他们将体外肿瘤诱导分化治疗模型—黑色素瘤细胞,经人成纤维细干扰素(IFN-β)和蛋白激酶C的激活剂mezerein(MEZ)共同处理后,诱导其生长抑制并引发了终末分化,将未处理和处理后黑色素瘤细胞的cDNA文库进行减数杂交,从而首次发现了后者有一新的黑色素瘤分化相关基因(mda-7)。2001年,基于对MDA-7基因定位、分子结构和细胞因子样特性的研究发现,人类基因命名委员会正式将其命名为白细胞介素24(IL-24)。 目前的研究表明,IL-24具有较明显的抗肿瘤作用,能选择性地抑制肿瘤生长,诱导多种肿瘤细胞凋亡,以及引起黑色素瘤细胞末端分化。而有关其免疫学功能的研究尚不系统。树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC),具有刺激初始T细胞增殖的独特功能。成熟的DC表达高水平的Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)以及某些粘附分子等。成熟的DC可将抗原提呈给T细胞,从而活化T细胞,启动免疫应答。基于DC的重要功能和在机体特异性免疫中的关键地位,我们设想IL-24的抗肿瘤作用可能与其激活了免疫应答反应有关,例如,IL-24可能激活抗原提呈细胞,增强其抗原递呈能力,从而引发了抗肿瘤免疫应答。因此,我们观察了IL-24对DC成熟和功能的调控作用。 本研究包括两部分内容。 一、重组人IL-24蛋白的表达、纯化和鉴定 取新鲜健康成人外周血经淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞(PBMC),用脂多糖(LPS)体外处理PBMC 24小时后,提取细胞的总mRNA,在oligo-dT15的引导下反转录合成cDNA。然后以此为模板,采用PCR扩增获得人IL-24 cDNA,将其插入pQE30表达载体,经酶切和测序筛选出正确的重组表达质粒后,转化至大肠杆菌M15(pREP4),转化子在2YT培养基中,用IPTG诱导表达, 第二军医大学硕士论文 经SDS一PAGE观察到约1 9 .6kDN端带有6个组氨酸(His)尾的IL一24重组蛋白 的表达,其主要以包涵体的形式存在于细菌胞内。为了得到没有LPS污染的工L一24 蛋白,包涵体经多次充分洗涤后,用7M盐酸肌溶解。变性蛋白通过His尾结合 到Ni‘鳌合柱进行初步纯化,然后在体外经精氨酸和甘油复性后,用HitraPQ 离子交换层析柱进一步纯化。纯化的重组IL一24蛋白经SDS一PAGE电泳银染,证 实其纯度大于95%,用堂试剂检测LPS含量小于0.03pg/ug蛋白。 二、重组IL一24蛋白对人DC成熟和功能的影响 1.不同状态的DC表达IL一24受体的分析 按常规方法培养至第五天的非成熟DC,分别加入lug/m1工L一24或lug/ml LPS 刺激40小时,收获DC,用以p一aCtin为内参进行RT一PCR分析IL一24受体mRNA 表达情况。结果发现,IL一24受体的IL一22RI单体表达水平在成熟DC有明显的 上调,IL一20R2表达水平在成熟和未成熟DC上没有明显的差异,而IL一20RI 在上述两种状态下的Dc中均未见有表达。lug/ml IL一24作用Dc可上调其 IL一22RI的表达,而其它两个受体单体的表达与未成熟DC相比,没有显著差别。 提示IL一24在DC发挥生理功效可能是通过IL一22RI八L一ZORZ受体异二聚体介导 的。 2.IL一24诱导DC分泌细胞因子 用ing/ml、10ng/ml、100ng/ml、lug/ml IL一24或lug/ml LPs分别刺激培 养至第五天的DC,24小时后用定量ELISA方法测定上清中工L一6、IL一12、1L一1 p、TNF一Q的含量,为排除所用蛋白中含有LPS的可能,我们又设置了重组IL一24 煮沸热变性对照组。结果发现,IL一24能诱导DC产生工L一6、工L一12、IL一lp、TNF- a,并且存在着剂量依赖效应。变性处理的IL一24则不再有诱导DC产生这四种 细胞因子的能力。这些结果表明,工L一24具有诱导DC分泌IL一12等Thl类细胞 因子和IL一6、儿一lp、TNF一Q等促炎性细胞因子的能力。 3,IL一24诱导DC分泌趋化因子 按常规方法培养至第五天的非成熟oC,分别与Ing/ml、10ng/ml、loong/ml、 lug/ml重组工L一24蛋白继续共孵育36小时,收集细胞培养上清,用定量ELISA 试剂盒检测上清中IP一10和MIP一IQ的含量,结果发现,这两种趋化因子的产生 水平与IL一24的作用呈显著的剂量依赖关系,并据此实验结果选择lug/m1工L一24 第二军医大学硕士论文 与DC分别作用0、12、24、36小时,发现IL一24刺激DC分泌IP一10和MIP一la 随着时间进程呈现一定得趋势。IP一10分泌量略微升高,而M工P一la的分泌量则 明显下降。同时在工L一24煮沸热变性对照组没有检测到DC分泌上述两种趋化因 子,而LPS刺激的阳性对照组检测到了较高水平的上述两种趋化因子的分泌。表 明该作用是工L一24的生物学功能,而不是其重组蛋白中可能会有的LPS污染。 4.工L一24促进DC功能成熟 将培养至第五天的非成熟De,经long/ml、100ng/ml、lug/ml IL一24作用 48小时后,流式细胞仪检测DC表型,结果与空白对照组相比,DC表面CDSO、 CD86、HLA一DR分子均明显上调,同时在lug/ml LPS阳性对照组也观察到相一致 的结果,提示I


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