Fas Ligand基因修饰的骨髓树突状细胞抑制GVHD反应和机理

【摘要】：FasL 基因修饰的树突状细胞抑制 GVHD 反应和机理 同种异基因骨髓移植(allo-gene Bone Marrow Transplantation,alloBMT)是 治疗恶性血液疾病、血液系统遗传性疾病、再生障碍性贫血等疾病的一种有 效方法,不幸的是移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease, GVHD)仍然是 其主要的并发症,并且具有高发病率、高死亡率,严重限制了alloBMT的应用 和发展。供体移植物中的T淋巴细胞识别宿主主要和次要组织相容性抗原导致 了GVHD的发生。尽管人们采用了各种各样的方法来预防和治疗GVHD,但至 今仍然没有一种方法令人满意。在移植前去除移植物中T淋巴细胞虽然可以有 效防止GVHD发生,但肿瘤复发和感染的几率却大大增加,移植物成活的几率 也因T细胞的减少而降低,因此并没有降低患者的总体死亡率。一些临床和实 验 研 究 已 经 表 明 引 起 GVHD 和 移 植 物 抗 白 血 病 作 用 ( Graft Versus Leukocythemia,GVL)的T细胞具有异质性,并且可以分离。体外也可以扩增 针对肿瘤特异性抗原的T淋巴细胞,体内应用能够介导GVL作用而不会导致 GVHD的发生。 树突状细胞(Dendritic Cell,DC)是一种功能最强大的抗原提呈细胞,目前 发现只有它可以激活初始型T细胞,也是触发GVHD关键细胞。基因修饰的DC 可以用来人工调控免疫反应,比如IL-10和TGF等基因修饰的DC可以使其具有 诱导耐受的潜能,而肿瘤抗原基因修饰的DC则可以作为肿瘤疫苗激发抗肿瘤 免疫。 Fas ligand(FasL),是TNF超家族II型膜蛋白,与受体Fas结合可以诱导表达 Fas的细胞凋亡。Fas/FasL途径的凋亡在免疫系统具有非常重要的作用:调节 外周T细胞增殖平衡;参与T细胞胸腺阴性选择作用;是细胞毒性T细胞的一种 重要杀伤机制;在眼、睾丸等免疫豁免部位形成中也具有重要作用。研究表 明一部分脾源性和髓源性DC可表达FasL,并能诱导活化的CD4+T细胞凋亡。 Wei等模拟这种生理机制用转染FasL基因的DC(FasL-DC)成功诱导了特异性 同种异基因低反应性,并延长了小鼠心脏移植物的存活时间。 基于以上前人的研究,我们认为用受体来源的DC(因为GVHD关键的第一 2 第二军医大学硕士研究生论文 WP=7 Fas Ligand 基因修饰的树突状细胞抑制 GVHD 反应和机理 步是受体抗原提呈细胞呈递抗原给供体T淋巴细胞),转染FasL基因后体外与 供体骨髓移植物混合培养,有希望能够选择性清除引起GVHD反应的T淋巴细 胞,而保留抗肿瘤、抗感染的淋巴细胞。本研究通过混合淋巴细胞培养(Mixed Leukocyte Reaction ,MLR ) 和 小 鼠 GVHD 模 型 ( C57BL/6 BALB/c , H-2b H-2d)等实验证明了这一点,FasL-DC成功诱导了特异性同种异基因 低反应性,有效抑制了GVHD的发生。 基因转染后流式检测 DC 高表达 FasL;通过凋亡分析,没有发现明显的 DC 凋亡;对基因转染前后 CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、MHCⅡ等表型 进行分析,没有发现明显改变;BALB/c 小鼠 FasL-DC 与异基因 C57BL/6 小 鼠脾 T 淋巴细胞共培养 48 小时后,通过流式可检测到明显 T 细胞凋亡,而 LacZ-DC、Day-7-DC 处理的对照组未发现明显凋亡。这些说明 FasL 基因转 染后没有改变 DC 原有活性和基本功能,作为本目的基因的表达载体具有可 使用性,表达的 FasL 具有良好的活性,可有效诱导反应性 T 淋巴细胞凋亡。 通过[3H]-TdR 掺入法检测异基因混合淋巴细胞增殖情况表明,经 FasL-DC 预 处理组与对照组相比显著抑制了淋巴细胞增殖,但在与无关第三者(C3H) 细胞共培养时,仍显示出强的增殖能力,说明 FasL 基因修饰的 DC 不但能诱 导低反应性,而且具有抗原特异性。细胞毒性 T 细胞是 GVHD 最主要效应细 胞,抑制这部分细胞的产生可有效抑制 GVHD 发生。体外用受体细胞刺激供 体淋巴细胞可诱导产生这种效应细胞,但是用FasL-DC预处理供体淋巴细胞, 可有效抑制这种效应细胞的产生;同样,这种抑制是特异性的,因为 FasL-DC 预处理供体淋巴细胞仍可产生针对第三方(C3H)的细胞毒性。因为是特异 性抑制因此它也保留了抗肿瘤抗感染的功能。 与体外结果一致,致死剂量照射的受体鼠在接受供体骨髓细胞移植后, 不管是未治疗组还是Lacz-DC治疗组,在两周后均出现了明显的GVHD症状: 脱毛,腹泻,弓背体位,体重持续下降,活动能力差等,GVHD 评分 10 分 左右。而 FasL-DC 治疗组仅出现轻微的毛乱,活性稍降低等,体重下降三周 后又重新增加,所有症状在两个月内基本恢复正常,GVHD 评分在 4 分左右。 FasL-DC 治疗组三个月生存率在 80%以上,而对照组生存期没有超 30 天, 在具有 GVHD 表现受体鼠可以观察到小肠绒毛断裂,基底腺破坏,基底层淋 3 第二军医大学硕士研究生论文 WP=8 Fas Ligand 基因修饰的树突状细胞抑制 GVHD 反应和机理 巴细胞浸润;皮肤表皮和真皮分离,基底层淋巴细胞浸润;肝脏汇管区淋巴 细胞浸润,小胆管破坏等。而 FasL-DC 治疗组没有出现明显的病理学变化。 嵌合体分析可见三周时各组均有供体细胞嵌合;三个月时治疗组仍然保持比 较高的嵌合,但对照组在三周后都已死亡。说明治疗组?