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人线粒体DNA缺失突变检测的研究

朱克军  
【摘要】:人线粒体DNA(mtDNA)是存在于线粒体内的双链环状DNA分子,长16,569bp,基因编码产物包括2种rRNA、22种tRNA及13种多肽链。其中多肽链均是氧化磷酸化酶复合体的重要组成成分,而rRNA和tRNA则参与这些多肽链的合成。因此,mtDNA上任何基因的突变,都可能影响线粒体氧化磷酸化的功能,从而造成细胞的某些病理性改变。研究发现,mtDNA受到氧化性损伤后会引起缺失和插入突变以及点突变等。近十年来,已经发现mtDNA缺失突变与衰老以及一些退行性疾病有关。同时,在其它一些疾病如肿瘤、家族性耳聋等,一些mtDNA缺失突变也被检测到。 开展这方面相关的研究,准确全面地检测mtDNA缺失突变十分必要。但目前对于mtDNA缺失突变,检测的准确性、系统性都还没有很好地解决。所以,虽然人们早已注意到mtDNA缺失突变在衰老及多种人类疾病中有重用作用,但到底是什么样的作用,至今仍无定论。甚至有些矛盾的实验数据。我们认为,要明确mtDNA缺失突变在衰老或其它一些病理状态中的意义,首先必须保证实验结果的科学性。对于mtDNA缺失突变的检测来说,就是要保证其准确性和系统性。 本实验主要探讨人mtDNA缺失突变检测准确性和系统性的方法学,在此基础是上,对人mtDNA缺失突变在肿瘤和衰老中的发生情况及意义进行初步的研究。 一.改进了人mtDNA的制备方法 为了建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法,本研究以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚一氯仿抽提,TE或ddH_2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果发现用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。 二.进一步完善了我们实验室已经建立的“改良PCR法” 我们曾经用改进的PCR的方法从遭受~(60)Co辐照的病人外周血中发现了一种新的889bp的mtDNA缺失突变。在这种改良的方法中,第一次PCR的产物中可疑的 第二军医大学硕士论文 人线杜体ONA缺失突变检浏的研究 带回收后同时用原引物对和内迁引物对扩增,电泳时只有在凝胶上发现两组引物对 有相等的(仅相差约20bp)的最长产物带时,我们才认为第一步PCR产物来自于 真正的mtDNA缺失。但是,在一种极端的情况下,这种改良的PCR法可能漏掉真 正的mtDNA缺失。就是当缺失断点与引物3’端很近(小于10个碱基),甚至紧邻 着引物的3’时,尽管第一步PCR产物确实来自于真正的mtDNA缺失,但由于内 迁引物对之一没有锚合位点,不可能扩增出与使用原引物对扩增相等的最长产物。 所以,我们会将这样的第一次PCR的产物视为“假产物”,即认为它是来自其中一 条引物的错配。 正因为存在这样的情况,我们认为当第一次PCR的产物回收后用内迁引物对未 能扩增出与使用原引物对相等的最长产物时,马上断定该第一次PCR的产物就是 “假产物”尚且为时过早。为了解决这样的问题,我们用原引物对和外迁引物对(即 原引物向外迁10bp)同时扩增原始的mtDNA模板,如果在凝胶上发现两组引物对 扩增产物中有相等的(仅相差20bp)的小于最长产物的条带,(一般说来,在凝胶 电泳上,外迁引物对扩增的产物比原引物对扩增的产物要淡的多,即PCR产物的量 要少得多。这是因为原引物的扩增产物中既有包含缺失断点的真缺失,也有来自其 中一条引物的错配的“假产物”。而外迁引物的扩增产物中仅有包含缺失断点的真缺 失。)那么这样的第一次PCR的产物就并非是“假产物”,而是包含缺失断点的真缺 失。 实验结果证实了我们的假设.我们从培养的SMMC一7721细胞株中检测到一种 新的缺失突变。用我们先前建立的改良PCR法会漏掉此突变。缺失片断大小为 4857bp,缺失片段为83lont-13166nt之l’ed序列,异常连接处两端有2个5一bp(CTAAC) 的直接重复序列。 三.建立了系统筛选人mtDNA缺失突变的方法 目前检测mtDNA缺失突变的方法主要有PCR和Southem Bfot。在这方面,PCR 具有更多的优点,采用PCR方法,可以快速的检测样品中低水平的缺失突变,而 Southem Blot需要检测样品至少2一3 pg,而且需几天才能完成,同时突变比例必须 超过5%才能被检测到。因此,PCR方法应用更为普遍。在具体应用PCR方法检测 线粒体DNA缺失突变时,主要有以下两种途径:一是在D一fo叩区设计一对引物, 用fong PCR技术扩增整个约16.6kb的线粒体DNA分子:二是通过限制PCR条件 第二军医人学硕士论丈 人线拉体DNA缺失突变检测的研究 (如控制延伸时间,使用普通Taq酶等)来扩增某一区段突变型的线粒体DNA分 子,同时,设计多对引物分别检测线粒体DNA不同区段的缺失突变。我们认为, 无论是哪一种方法,都存在一定的缺陷。对于long PcR,首先是PcR的条件要求 高,扩增时间长,结果也不稳定。而且,对于一些相对小片断的缺失,容易被遗漏; 对于上面提到的第二种检测思路,也常常是顾此失彼,难以保证涵盖mtDNA所有 的区段。我们综合以往的研究思路和方法,设计了3对引物


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