收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

查尔酮合成酶等黄酮代谢基因的克隆及短葶飞蓬遗传转化研究

刘成洪  
【摘要】:药用植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.是提取灯盏花素的主要原料来源,由于大量采挖使野生资源遭到了严重破坏,目前灯盏花药材主产地云南省已开展了人工种植的尝试,但在大规模种植中存在种苗繁殖慢、种质退化等问题。本研究首先利用短葶飞蓬种子消毒后在MS_0培养基发芽壮苗建立了快速育苗方法,育苗时间缩短到40~50d。在此基础上,通过叶柄离体培养经愈伤组织诱导不定芽建立起了一个有效的植株再生体系。结果表明叶柄相对于叶片更容易诱导出愈伤组织;在MS基本培养基上添加1.0mg/L 6-BA和1.0 mg/LNAA可促进愈伤组织的诱导,提高BA浓度到2.0mg/L有利于获得分化能力强的绿色致密愈伤组织,高浓度6-BA(4.0mg/L)和0.2 mg/L NAA配合可获得较高的愈伤组织分化芽得率(90.00±1.53%)。该体系可进一步应用于生物技术对短葶飞蓬实施品质改良的研究。 在前人对黄酮类化合物(Flavonoid)比较详尽的研究基础上,对短葶飞蓬中活性成分灯盏乙素(黄酮苷)的生物合成途径进行了假设,选取了其中四个相关代谢酶来研究它们在灯盏乙素生物合成中的作用。本研究中,根据相关报道从不同物种获得了这四个基因编码区片段[chs来自银杏Gingko biloba L.,fs Ⅱ来自紫苏 Perilla frutescens(L.)Britt.,f6h来自大豆Glycine max L.,ubgat来自黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.]。序列验证后,这些目的基因片段通过双酶切法被整合到植物双元表达载体pCAMBIA1304或pCAMBIA2301上,然后将这些构建好的工程质粒载体导入到根癌农杆菌EHA105和发根农杆菌C58C1中,分别用于转化短葶飞蓬叶柄与叶盘外植体。 同时,利用RACE-PCR技术从短葶飞蓬叶中首次克隆出了查耳酮合成酶基因(Ebchs),全长cDNA为1449bp,含有一个1215bp的编码区序列。对该基因及其推导氨基酸序列与菊科其他物种进行比对分析表明它们具有较高的同源性。Southern杂交分析表明该基因属于一个多基因编码家族。半定量RT-PCR表明该基因在短葶飞蓬植株的各个部位都有mRNA水平的表达,其中在叶片中的表达量最高。 在农杆菌介导的转化程序中,通过试验确定了潮霉素筛选的浓度为10mg/L,菌液侵染时间不超过10min,共培养时间为2d为宜。通过PCR初步检测,外源基因已被转入短葶飞蓬愈伤组织和毛状根中,但不同基因的转化发根中阳性转化率差异较大。对于获得的转基因毛状根,在脱菌完全后转入液体振荡扩大培养,毛状根的生长速率总体上表现为共同的趋势:B_51/2MSMS1/2B_5,生长周期约为40d左右。利用半定量RT-PCR进一步验证了各目标基因的mRNA表达水平,黄酮代谢相关的4个基因在部分转化发根系分别获得了表达。 利用紫外分光光度计和HPLC,分别测定了短葶飞蓬再生植株不同部位与转基因发根中总黄酮和灯盏乙素含量。结果表明,在人工控制条件下植株中不同部


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前15条
1 董志渊;李林玉;王馨;杨斌;杨丽英;李绍平;;短葶飞蓬种子活力测定方法的初步研究[J];安徽农业科学;2013年03期
2 李鹂;党承林;黄瑞复;;三倍体短葶飞蓬的发现及其在育种上的意义[J];云南植物研究;2007年01期
3 李秀华;苏文华;周鸿;张光飞;;大气二氧化碳倍增对短葶飞蓬生长和有效成分积累的影响[J];应用生态学报;2009年08期
4 苏文华;张光飞;周鸿;张亚妮;;短葶飞蓬黄酮及咖啡酸酯的含量与土壤氮供应量的关系[J];植物生态学报;2009年05期
5 苏文华;张光飞;周鸿;闫海忠;周睿;;短葶飞蓬总咖啡酸酯和灯盏乙素含量的空间变化[J];生态学报;2010年04期
6 史云东;沈涛;贾琳;金航;;云南不同地点短葶飞蓬中野黄芩苷含量比较[J];安徽农业科学;2011年05期
7 史云东;袁天军;贾琳;金航;;不同产地短葶飞蓬中总黄酮含量的比较[J];安徽农业科学;2011年04期
8 李鹂;党承林;;短葶飞蓬(Erigeron breviscapus)的花部综合特征与繁育系统[J];生态学报;2007年02期
9 张亚妮;苏文华;张光飞;;土壤水分胁迫对短葶飞蓬有效成分含量的影响[J];中国中药杂志;2009年10期
10 苏文华;张光飞;周鸿;郭晓荣;张磊;;氮素对短葶飞蓬生长和次生代谢产物积累的影响[J];云南植物研究;2010年01期
11 苏文华;张亚妮;张光飞;周鸿;;土壤类型对短葶飞蓬灯盏乙素和咖啡酸酯积累的影响[J];武汉植物学研究;2009年04期
12 董志渊;王馨;李林玉;杨斌;严世武;杨丽英;李绍平;;短葶飞蓬减数分裂、雄配子体发育过程及其花部形态特征[J];热带亚热带植物学报;2010年06期
13 苏文华;张光飞;郭晓荣;周睿;;钾素对药用植物短葶飞蓬生长和有效成分积累的影响[J];植物分类与资源学报;2011年04期
14 林丽飞;夏瑞娥;刘春国;张灿邦;刘波;王小军;王芳;;不同因素对短葶飞蓬愈伤组织的影响[J];江苏农业科学;2013年02期
15 林丽飞,胡先奇,江楠;短葶飞蓬锈病的初步研究[J];华中农业大学学报;2004年05期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 苏文华;张光飞;张丽华;李秀华;;短葶飞蓬黄酮积累与生长的平衡关系[A];中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编(1933—2003)[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘成洪;查尔酮合成酶等黄酮代谢基因的克隆及短葶飞蓬遗传转化研究[D];第二军医大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 沈云玫;栽培酸碱度与采后处理对短葶飞蓬(Erigeron breviscapus (Van.)Hand-Mazz)有效药用成份的影响[D];云南大学;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978