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查尔酮合成酶等黄酮代谢基因的克隆及短葶飞蓬遗传转化研究

刘成洪  
【摘要】:药用植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.是提取灯盏花素的主要原料来源,由于大量采挖使野生资源遭到了严重破坏,目前灯盏花药材主产地云南省已开展了人工种植的尝试,但在大规模种植中存在种苗繁殖慢、种质退化等问题。本研究首先利用短葶飞蓬种子消毒后在MS_0培养基发芽壮苗建立了快速育苗方法,育苗时间缩短到40~50d。在此基础上,通过叶柄离体培养经愈伤组织诱导不定芽建立起了一个有效的植株再生体系。结果表明叶柄相对于叶片更容易诱导出愈伤组织;在MS基本培养基上添加1.0mg/L 6-BA和1.0 mg/LNAA可促进愈伤组织的诱导,提高BA浓度到2.0mg/L有利于获得分化能力强的绿色致密愈伤组织,高浓度6-BA(4.0mg/L)和0.2 mg/L NAA配合可获得较高的愈伤组织分化芽得率(90.00±1.53%)。该体系可进一步应用于生物技术对短葶飞蓬实施品质改良的研究。 在前人对黄酮类化合物(Flavonoid)比较详尽的研究基础上,对短葶飞蓬中活性成分灯盏乙素(黄酮苷)的生物合成途径进行了假设,选取了其中四个相关代谢酶来研究它们在灯盏乙素生物合成中的作用。本研究中,根据相关报道从不同物种获得了这四个基因编码区片段[chs来自银杏Gingko biloba L.,fs Ⅱ来自紫苏 Perilla frutescens(L.)Britt.,f6h来自大豆Glycine max L.,ubgat来自黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.]。序列验证后,这些目的基因片段通过双酶切法被整合到植物双元表达载体pCAMBIA1304或pCAMBIA2301上,然后将这些构建好的工程质粒载体导入到根癌农杆菌EHA105和发根农杆菌C58C1中,分别用于转化短葶飞蓬叶柄与叶盘外植体。 同时,利用RACE-PCR技术从短葶飞蓬叶中首次克隆出了查耳酮合成酶基因(Ebchs),全长cDNA为1449bp,含有一个1215bp的编码区序列。对该基因及其推导氨基酸序列与菊科其他物种进行比对分析表明它们具有较高的同源性。Southern杂交分析表明该基因属于一个多基因编码家族。半定量RT-PCR表明该基因在短葶飞蓬植株的各个部位都有mRNA水平的表达,其中在叶片中的表达量最高。 在农杆菌介导的转化程序中,通过试验确定了潮霉素筛选的浓度为10mg/L,菌液侵染时间不超过10min,共培养时间为2d为宜。通过PCR初步检测,外源基因已被转入短葶飞蓬愈伤组织和毛状根中,但不同基因的转化发根中阳性转化率差异较大。对于获得的转基因毛状根,在脱菌完全后转入液体振荡扩大培养,毛状根的生长速率总体上表现为共同的趋势:B_51/2MSMS1/2B_5,生长周期约为40d左右。利用半定量RT-PCR进一步验证了各目标基因的mRNA表达水平,黄酮代谢相关的4个基因在部分转化发根系分别获得了表达。 利用紫外分光光度计和HPLC,分别测定了短葶飞蓬再生植株不同部位与转基因发根中总黄酮和灯盏乙素含量。结果表明,在人工控制条件下植株中不同部


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