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人单核细胞(THP-1)cDNA表达文库的构建及趋化因子CXCL14(MIP-2γ/BRAK)受体的寻找

刘斌  
【摘要】:趋化因子MIP-2y是本实验室于2000年从人树突状细胞cDNA文库中通过大规模随机测序而独立发现的一个属于CXC家族的新型趋化因子(BRAK为另一个研究小组给以的命名,CXCL14为国际专门命名委员会给以的统一名称,下文将一律使用CXCL14这一名称)。研究表明CXCL14对中性粒细胞具有强力的趋化作用,对树突状细胞具有较弱的趋化作用,而对单核细胞、NK细胞、T和B淋巴细胞不具有趋化作用。该趋化因子在大多数正常组织中呈组成型表达,而在大多数肿瘤细胞系中未能检测到。目前关于该趋化因子在体内的具体生理作用还不清楚,这主要是由于迄今为止该趋化因子的受体还未被克隆出来。 趋化因子受体属于七次跨膜的G蛋白耦联受体(GPCR)超家族,而GPCR是当前临床用药最主要的靶点。目前还有约150个所谓孤儿GPCR的天然配体及功能未知,国际上有多家实验室和许多生物及制药公司一直致力于破解(deorphanize)这些孤儿GPCR,包括寻找CXCL14受体,这一方面对于深入研究CXCL14的功能是必需的,同时也具有极大的临床开发前景,可至今还未克隆成功。本研究也是想通过不同的策略和技术路线来克隆CXCL14的受体。 在克隆不同的膜受体时所采用的技术路线既有其共性也有其个性的地方。在克隆未知受体时可以参照以前成功克隆到的受体的方法,但是并无普遍适用且保证能成功的方法可以遵循。为了克隆CXCL14的受体,我们依次尝试了如下策略和技术路线。 首先,我们采用了GST pull-down的方法。通过构建CXCL14-GST融合表达载体,在大肠杆菌中获得了可溶性高表达的CXCL14-GST融合蛋白。将该融合蛋白结合在GST亲和柱上。通过本实验室以前的生长实验结果选定对CXCL14有反应的KG-1细胞作为靶细胞,再通过蔗糖密度梯度高速离心制备KG-1细胞膜蛋白组分,在该膜蛋白组分中应该含有CXCL14的受体。然后将细胞膜蛋白组分流过结合有CXCL14-GST融合蛋白的GST亲和柱作为实验组,同时让相同量的靶细胞膜蛋白样品流过只结合有GST的亲和柱作为对照组。洗去非特异性结合的蛋白后,用20mmol/1还原型谷胱甘肽(GSH)进行洗脱,然后将洗脱样品进行SDS-PAGE电泳,再分别进行考马斯亮兰染色和银染色。如果CXCL14的受体被CXCL14-GST融合蛋白结合的话,那么比较实验组和对照组就应该发现前者比后者多出一条额外的蛋白带,但遗憾的是经过多次重复实验都没有发现一条额外的蛋白带。因此只有放弃此法另寻它途。 接下来我们采用了免疫共沉淀的方法。首先也是制备靶细胞膜蛋白样品,然后将其与CXCL14以及抗CXCL14的抗体和蛋白A珠子混合作为实验组,对照组除了不含CXCL14外其余与实验组完全一样。洗去非特异结合的蛋白后,进行SDS-PAGE电泳,


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