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应用RNA干扰技术对新生隐球菌CNLAC1基因功能的初步研究

涂宏钢  
【摘要】:研究背景: 隐球菌病是新生隐球菌感染所致的全身感染性疾病,好发于细胞免疫功能低下患者。近年来隐球菌感染发生率呈明显上升的趋势,突出表现在爱滋病人群中,成为AIDS患者最常见的并发症之一,也是AIDS患者死亡的首要原因。 2000年3月启动的新生隐球菌基因组计划由斯坦福大学基因组技术中心(SGTC)和美国国家基因组中心(TIGR)联合于近期完成,为我们下一步的研究奠定了坚实的基础。但破解基因组的序列只是一个起点,许多毒性相关基因的确切致病机理仍有待研究。 要对某一基因的功能进行研究,按照经典的分子遗传学方法,就必须应用同源重组的方法将该基因敲除,得到人工突变株,在此平台基础上,我们才可以通过该转化子的形态、结构、功能、传代过程和生理生化表现及其毒力的改变深入地研究该基因的功能。不过应用基因同源重组进行相关基因敲除来研究其功能,耗时费力且成功率低,为全世界科研工作者所遇到的共同难题。 而近年来兴起的RNA干扰技术(RNAi),即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA(siRNA)进行转录后基因沉默,已经迅速而广泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,·RNA干扰技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐,即如果在实验设计中,在靶细胞中引入长双链RNA中有与靶基因所转录的mRNA同源的序列,即可触发“扳机”,引起特定的转录后基因沉默,使该基因功能丧失或部分丧失,从而明确其功能。 研究目的: (1) 构建RNA干扰质粒Pcnlacl-tel,正义RNA质粒Pcnlacl-S-tel,反义RNA质粒Pcnlacl-A-tel的构建 (2) 摸索隐球菌转化的条件,进行一整套转化体系的构建 (3) 应用RNA干扰技术研究酵母的基因功能,建立了一套完整的酵母基因功能研究体系及技术平台,进一步推广至其它酵母的基因功能研究。


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