应用慢病毒载体介导RNA干扰在MCF-7细胞中剔降IKKα基因和制备转基因小鼠模型的研究

【摘要】：近年研究表明,乳腺肿瘤细胞中,IκB激酶-α(IκB kinase-α,IKKα)对激活NF-κB乃至其后的病变发挥着极其重要的作用。肿瘤坏死因子家族成员receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)与其受体(RANK)结合,激活IKKα蛋白,释放NF-κB蛋白转位进入细胞核。在核内促使CyclinD 1的表达,若该表达持续进行将会导致乳腺上皮细胞的增生、癌变。该通路是经典的TNFR-IKKβ-NF-κB及LT-IKKα-NF-κB通路之外的另一重要信号转导途径,称之为RANKL-IKKα-NF-κB通路。它的异常表达是导致乳腺肿瘤形成的早期事件之一。本课题针对NF-κB信号转导通路中的重要枢纽因子IKKα,通过应用慢病毒载体(lentiviral vector)介导的RNAi效应,剔降(knockdown)乳腺肿瘤细胞MCF-7的IKKαm RNA,使其表达量下降,从而降低下游NF-κB蛋白的过度激活,以至恢复到正常水平,避免乳腺肿瘤的发生发展。 此外,采用慢病毒载体感染受精卵方法,取代传统显微注射,建立了表达IKKα基因剔降的转基因小鼠模型,目前已繁殖至F2代。通过实时定量PCR技术验证,转基因小鼠血液中IKKα m RNA水平,明显低于野生型小鼠。该模型的建立为在体内开展IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生关系的研究创造良好条件。上述研究工作在国内外尚未见文献报道。 课题研究的内容包括以下四个主要部分: 1.pU6-IKKα-knockdown表达载体构建。 2.瞬时转染pU6-IKKα-knockdown表达载体剔降MCF-7细胞中IKKα的m RNA的研究。 3.IKKα-knockdown慢病毒载体的构建、稳定转染及用于乳腺肿瘤基因治疗的初步观察。