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HBx羧基端缺失40个氨基酸相关上调/下调基因的筛选和初步功能研究

王力  
【摘要】:慢性乙肝病毒(HBV)感染是肝细胞癌(HCC)发生发展的一个主要危险因素。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与HBV相关的HCC形成密切相关,HBx的自然突变普遍存在于肝癌组织中,HBx突变在HBV相关的HCC形成过程中可能起着关键性的作用。体外研究表明,转染HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸(HBx3′-40)的肝癌细胞具有明显的促进细胞增殖和致瘤能力。为进一步探讨HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸在肝癌发生中的作用,本研究采用抑制性消减杂交技术(SSH)结合基因表达谱芯片筛选HBx蛋白羧基端缺失40个氨基酸相关的上调/下调基因并对其功能进行初步研究。用SSH方法得到了87条基因,其中上调基因55条,下调基因32条。用基因表达谱芯片得到差异表达基因167条,其中上调基因145条,下调基因22条。用生物信息学分析这些基因的功能及与肝细胞癌形成的可能关系。选出三个有意义的基因Wnt5a、ETV5和DKFZ,用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测三个基因在肝癌细胞株、肝癌和癌旁组织中的mRNA表达情况。结果表明三个基因在pcDNA-HBx3′-40转染的Huh7细胞中的mRNA表达水平均高于pcDNA-HBx转染的Huh7细胞;除Wnt5a基因外,在肝癌组织中的mRNA表达水平高于癌旁组织。推测ETV5、DKFZ两个基因可能与细胞的增殖相关。用免疫组织化学和Western blot方法分析Wnt5a、P53、P21~(WAF1)在肝癌细胞株、肝癌及癌旁组织中的表达情况及相互关系,证实P53和P21~(WAF1)在肝癌组织的表达高于癌旁组织,而Wnt5a相反。Wnt5a在pcDNA-HBx3′-40转染的Huh7细胞株中的表达高于pcDNA-HBx转染的Huh7细胞,而P21~(WAF1)相反。P53在二株细胞中的表达没有显著差异。Wnt5a的表达与P53和P21~(WAF1)密切相关,Wnt5a可能与P53和P21~(WAF1)信号分子相互作用并参与了肝细胞癌的发生。


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