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HBV cccDNA特异性定量检测方法筛选优化及应用研究

郝勇  
【摘要】:乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是HBV复制早期即开始合成一种中间体,由cccDNA反转录形成pgRNA及其他一系列RNA,开始病毒的复制增殖,cccDNA存在及数量标志着HBV的复制和复制的活跃程度。cccDNA的检测在HBV清除机制研究、抗HBV药物机制及药效学研究、对不同的乙型肝炎患者病情变化的监测均有重要的应用价值。但由于其结构上和生物学方面的特殊性,cccDNA特异性检测一直存在较大的难度。自二十世纪90年代初,不断有学者发明新的cccDNA特异性检测方法,但均未能推广。另外,目前有关cccDNA的研究数据大多通过鸭、土拨鼠、黑猩猩等实验动物模型和细胞模型中获得,而直接从慢性乙型肝炎患者等临床病人中获得的资料仍然比较缺乏。本课题从目前有关cccDNA特异性检测方法中筛选几种可能性比较大的方法进行验证,将能确切提高cccDNA检测特异性和灵敏度的方法进行优化,作为一种方法的几个步骤组合起来,并用此方法检测肝移植术后不同时期患者的外周血单个核白细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及慢性乙型肝炎患者的PBMC和肝组织穿刺标本。 本课题分为三个部分:一、HBVcccDNA特异性检测方法的筛选及优化;二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝组织中HBV cccDNA定量检测;三、肝移植患者外周血单个核细胞中HBV检测及临床意义。 一、HBV cccDNA特异性检测方法的筛选及优化 目的 对目前几种cccDNA特异性检测方法进行筛选,选择能更好地提高cccDNA检测特异性的几个方法组合起来,并将此组合的方法进行优化完善。方法 根据文献报道,选择理论上可以提高cccDNA检测特异性的几种方法:十二烷基硫酸钾(potassium dodecyl sulfate,PDS)-蛋白质沉淀核酸抽提法,嵌合引物(chimeric primer)cccDNA特异性检测法,特异性核酸酶切法,跨rcDNA缺口的PCR扩增法和实时荧光PCR法等,以慢性乙型肝炎患者血清、肝组织标本及HBV质粒标准品鉴定、选择最佳的几个方法,作为分步骤组合为一个新的方法,再对每个步骤进行优化,提高检测方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果抽提HBV核酸后,先用不降解质粒的ATP依赖DNA酶(Plasmid-safe


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