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NR2B参与雌激素介导心理应激内脏高敏感的机制研究

苏军凯  
【摘要】: 研究背景 肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是临床常见疾病之一。目前诊断仍然依靠症状、排他性诊断,缺乏生化标志物及解剖学异常。内脏高敏感是目前公认的IBS重要病理生理机制之一。近来发现NMDA受体与内脏高敏感的形成和维持密切相关。NMDA受体是兴奋性氨基酸的特异性受体,参与体内各种信号传递和调节神经元的兴奋性。其中,含2B亚基的NMDA受体(NR2B)在伤害性感受的传递和调制、中枢可塑性形成中发挥重要作用。 流行病学研究提示IBS的发病以女性多见。动物实验研究亦表明皮下注射雌激素增加大鼠的内脏敏感性。雌激素作用包括,通过雌激素受体的基因组效应,和通过膜受体的非基因组效应。雌激素对内脏高敏感影响主要是通过何种效应发挥作用尚不清楚。 应激是IBS症状发生或加重的一个重要因素,雌激素影响着对应激的反应水平。雌激素是雌性大鼠急性束缚应激引起内脏敏感升高的必要因素。另外研究表明,避水应激,作为一种心理应激,可造成大鼠稳定、持续约30大的内脏高敏感。而雌激素是否影响慢性心理应激内脏高敏感形成,尚未见报道。 为此,本课题以避水应激为模型,研究雌激素对内脏高敏感形成的影响,并通过雌激素受体拮抗剂ICI 182,780、NMDA受体竞争性拮抗剂AP5、NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981进一步阐明雌激素作用机制。 方法与结果 1、雌性大鼠内脏高敏感模型的建立及检测 目的:我们首先观察避水应激是否引起正常雌性大鼠内脏高敏感形成,以明确定避水应激作为雌性大鼠内脏高敏感造模方法的可行性。 方法:通过埋置腹壁电极记录20-40-60-80mmHg梯度压力结直肠扩张内脏运动反射(VMR)腹外斜肌收缩的肌电图,计算曲线下面积,以VMR幅度值来评价大鼠的内脏痛敏感性。将16只成年雌性大鼠随机分成2组,避水应激组(WAS)和假应激组(shamWAS),分别予分别避水应激和假避水应激。连续应激10天,每天1小时。应激前,测VMR基础值;避水应激完成后,继续饲养4天,冉次测定后VMR幅度。开胸心室取血、以放射免疫法测定血浆CRF、ACTH的水平,灌注固定后取大脑用于c-fos免疫染色。比较WAS组和shamtWAS组大鼠VMR、血浆CRF和ACTH、杏仁核及室旁核c-Fos免疫阳性细胞(c-FLI)的差异。 结果:WAS引起雌性大鼠内脏高敏感,应激大鼠结肠无病理学改变。大鼠经反复避水应激后,WAS大鼠血浆ACTH浓度(77.19±22.71)pg/ml,明显低于假应激组shamWAS的(148.71±50.37)pg/ml(P0.01)。WAS大鼠血浆CRF浓度35.41±22.71pg/ml,与假应激组shamWAS的(43.82±14.76)pg/ml无明显差异。WAS组大鼠室旁核c-FLI数24.33±4.93,与sham-WAS组22.14±3.82之间没有显著性差异(p0.05)。WAS组大鼠杏仁核c-FLI数25.64±5.39,明显多于sham-WAS组19.62±3.62(p0.05)。 小结:WAS可作为雌性大鼠内脏高敏感造模方法。WAS后大鼠血浆ACTH水平降低,而CRF无变化。c-FLI数,在WAS大鼠杏仁核表达增加,而室旁核无变化。2、雌激素与内脏高敏感形成关系的研究 目的:P2X_3受体在介导痛觉中发挥重要作用。本部分实验观察雌激素是否影响避水应激大鼠内脏高敏感的形成,以及P2X_3受体蛋白表达变化。 方法:将卵巢切除后雌性大鼠32只随机分为侧脑室注射雌二醇(E2)后应激组(WAS+E2)、侧脑室注射E2后假应激组(shamWAS+E2)、侧脑室注射生理盐水后应激组(WAS+NS)、侧脑室注射生理盐水后假应激组(shamWAS+NS)。每次应激前30 min给予相应药物侧脑室注射,连续应激1O天,比较各组间应激前后内脏高敏感的变化。为进一步观察雌激素对内脏高敏感形成的影响,将WAS+E2、WAS+NS两组大鼠开胸心室取血用于CRF/ACTH放免测定,灌注固定取大脑c-fos免疫荧光染色,以及双侧腰1(L1)/骶1(s1)背根神经节(DRG)行P2X_3免疫荧光染色。比较WAS组和shamWAS组大鼠VMR、血浆CRF/ACTH、杏仁核及室旁核C-fos、DRG组织P2X_3表达的差异。 结果:卵巢切除后大鼠,应激(WAS+NS)组与假应激(shamWAS+NS)组之间,内脏敏感性没有统计学差异。WAS+E2组内脏敏感性明显高于wAS+NS组,提示给予雌激素后,心理应激大鼠内脏敏感性升高。WAS+E2组大鼠山浆CRF浓度为(36.81±11.1)pg/ml,与WAS+NS的血浆CRF浓度(45.78±14.55)pg/ml,没有统计学差异。相似的,WAS+E2组大鼠血浆ACTH浓度为(77.81±17.20)pg/ml,与WAS+NS的血浆ACTH浓度(67.61±17.01)pg/ml,没有显著性差异。应激大鼠结直肠扩张后,杏仁核c-fos免疫阳性细胞数,WAS+E2组26.38±3.96明显多于WAS+NS组19.28±4.54(p0.01);而室旁核C-fos免疫阳性细胞数,WAS+E2组26.12±5.74,与WAS+NS组22.43±3.87比较,两者之间没有统计学差异(p0.05)。应激大鼠DRG的P2X_3阳性细胞数占所有细胞数的比值,WAS+E2组(33.2±2.85)%明显多于WAS+NS组(38.38±3.31)%(p0.01) 小结:雌激素促进WAS大鼠内脏高敏感形成。雌激素不影响大鼠WAS后第4天血浆ACTH和CRF水平。雌激素增加WAS大鼠DRG的P2X_3受体表达。 3、雌激素对心理应激大鼠P2X_3、NR2B mRNA表达的影响 目的:P2X_3受体在DRG中表达,NR2B在DRG和前扣带回(ACC)中均有表达。雌激素增加WAS大鼠内脏高敏感,本实验进一步明确雌激素是否影响应激大鼠DRG组织P2X_3 mRNA,以及DRG、ACC组织NR2B mRNA的表达。 方法:将卵巢切除后雌性大鼠14只随机分为:侧脑室注射雌二醇后应激组(WAS+E2)、侧脑室注射生理盐水后应激组(WAS+NS)两组大鼠。连续侧脑室给药、应激10天。剪取大鼠腰1(L1)至骶2(S2)所有DRG以及前扣带回(ACC)组织,用real time PCR法比较DRG组织P2X_3、NR2B mRNA,以及ACC组织NR2BmRNA的水平。 结果:WAS+E2组大鼠DRG的P2X_3 mRNA表达明显多于WAS+NS组大鼠(p0.05)。ACC组织NR2B mRNA,WAS+E2组高于WAS+NS组(p0.05)。而DRG组织NR2B mRNA,WAS+E2组与WAS+NS组无显著性差异。 小结:雌激素增加WAS大鼠ACC的NR2B mRNA,以及DRG的P2 X_3 mRNA表达,但对DRG的NR2B mRNA无影响。 4、雌激素核受体、NR2B拮抗剂对雌激素作用的影响 目的:应用雌激素核受体拮抗剂ICI 182,780、NMDA受体竞争性拮抗剂AP5、NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981,进一步阐明雌激素核受体、NR2B在雌激素促进心理应激内脏高敏感形成的作用。 方法:将雌性大鼠32只卵巢切除后,随机分为侧脑室注射E2及ICI 182,780后应激组(WAS+E2+ICI)、侧脑室注射ICI 182,780后应激组(WAS+ICI)、侧脑室注射E2及Ro25-6981后应激组(WAS+E2+Ro)、侧脑室注射E2及AP5后应激组(WAS+E2+AP5),连续侧脑室给药、应激1O天。各组与单用E2组(侧脑室注射E2后应激WAS+E2组)、对照组(侧脑室注射生理盐水后应激WAS+NS组)的VMR相比较。 结果:与WAS+E2组比较,WAS+E2+ICI组只有在CRD 80mmHg压力降低VMR幅度(p0.05)。WAS+E2+ICI组大鼠,在CRD 60mmHg、80mmHg压力水平仍高于WAS+NS组大鼠的VMR幅度(p0.05)。WAS+E2+AP5组在60mmHg、80mmHg压力水平VMR幅度明显低于WAS+E2组大鼠。WAS+E2+Ro组在80mmHg压力水平VMR幅度低于WAS+E2组大鼠(p0.01)。 小结:ICI 182,780阻断雌激素增加WAS大鼠内脏高敏感的一部分作用。联合应用AP5、Ro25-6981,阻断E2促进内脏高敏感形成的作用。NR2B是参与E2促进内脏高敏感形成的重要信号传导通路之一。 5、雌激素对大鼠急性结直肠扩张内脏痛的影响 目的:NR2B参与雌激素促进慢性心理应激内脏高敏感的形成,阐述的足雌激素慢性或长期的作用。本部分实验分析雌激素的急性作用,观察单次侧脑室注射雌激素对大鼠急性结直肠扩张内脏痛的影响。 方法:(1)不同剂量E2对内脏痛敏感性的影响:卵巢切除后雌性大鼠24只,随机分为侧脑室注射高剂量E2 10 ug(H-E2组)、侧脑室注射中剂量E2 1.0 ug(M-E2组)、侧脑室注射低剂量E2 O.1ug(L-E2组)、侧脑室注射对照NS(NS组)。分别比较注射30 min和4 h后的VMR幅度。(2)不同拮抗剂对中剂量E2作用的影响:卵巢切除后雌性大鼠24只,随机分为侧脑室注射E2 1.0 ug(E2组)、侧脑室注射E2 1.0 ug和ICI 182,780(E2+ICI组)、侧脑室注射E2 1.0 ug+Ro25-698(E2+Ro)、侧脑室注射E21.0 ug+AP5(E2+AP5)。比较各组药物侧脑室注射30 min和4 h后的VMR幅度。 结果:(1)E2对非伤害性刺激20mmHg压力VMR肌电曲线下面积没有影响。E2剂量依赖性地增强CRD诱导的内脏伤害性刺激。高剂量组E2增加给药后30min的40mmHg(P0.05)、60mmHg(PO.01)、80mmHg(P0.05)压力VMR幅度。中剂量组E2增加给药后4h的40mmHg、60mmHg、80mmHg压力VMR幅度(均P0.05),高剂量组E2增加给药后4h的40mmHg(PO.05)、60mmHg(P0.01)、80mmHg(PO.05)压力扩张VMR幅度。(2)ICI 182,780,AP5,Ro25-698,在侧脑室注射30 min和4 h后,一定程度地抑制E2增加内脏高敏感。其中,以AP5最为明显。 小结:侧脑室注射雌激素增强大鼠急性结直肠扩张内脏痛敏感性,NR2B参与其调节作用机制。 结论 1、反复避水应激可引起雌性大鼠内脏高敏感。 2、雌激素促进慢性心理应激大鼠内脏高敏感的形成。 3、雌激素增加慢性心理应激大鼠DRG的P2X_3受体以及ACC组织NR2B表达。 4、NR2B参与雌激素介导心理应激内脏高敏感的形成。 5、侧脑室注射雌激素增强急性结直肠扩张内脏痛敏感性,NR2B参与其调节作用。


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