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X-连锁肾上腺脑白质营养不良的分子生物学研究

柯龙凤  
【摘要】: X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD)是最常见的过氧化物酶体病,主要侵犯肾上腺和脑白质等器官,根据临床表现Hugo等将其分为9型:MRI正常的无症状型、MRI异常的无症状型、MRI正常的单纯Addison病型、MRI异常的单纯Addison病型、轻度大脑型、重度大脑型、单纯肾上腺脊髓神经病型、大脑型合并肾上腺脊髓神经病型、小脑型,其中大脑型占47~48%。 X-ALD是由ABCD1基因突变所致,该疾病基因定位于染色体Xq28,其成熟mRNA长约3.7kb,编码一个含745个氨基酸残基的蛋白质,称为ABCD1蛋白。X-ALD的发病机制是由于体内的极长链饱和脂肪酸(saturated very long chain fatty acid,VLCFA)不能进入过氧化物酶体进行β-氧化,从而过度蓄积,导致脑白质脱髓鞘改变及肾上腺皮质功能减退。患者一旦发病,往往产生不可逆的神经系统症状。应用分子诊断方法,对X-ALD患者及其家系成员的ABCD1基因进行分析,确定患者的ABCD1基因突变位点和类型以及家系其他成员的基因型,不仅可为ALD患者提供明确的诊断,而且可为遗传咨询、产前诊断提供依据。 本研究分别从cDNA和基因组DNA两条途径为6个X-ALD家系进行分子诊断。采用长链RT-PCR技术,从患者外周血提取总RNA并合成cDNA,以cDNA为模板,扩增ABCD1基因编码区全长,再分4个片段进行二次PCR,并对PCR产物直接测序;应用DHPLC、DNA测序等方法分析患者的基因组DNA,进一步确证其ABCD1基因突变。结果显示:6个X-ALD家系患者的ABCD1基因上均存在突变,其中患者1的ABCD1基因第177位密码子发生了CAG→TAG突变,使原来编码的谷氨酰胺被终止密码子取代(Q177X);患者2的ABCD1基因第401位密码子发生了CGG→CAG突变,使原来编码的精氨酸被谷氨酰胺取代(R401Q);患者3的ABCD1基因第276位密码子发生了AAG→GAG突变,使原来编码的赖氨酸被谷氨酸取代(K276E);患者4的ABCD1基因第174位密码子发生了TAC→TGC突变,使原来编码的酪氨酸被半胱氨酸取代(Y174C);患者5的ABCD1基因第602位密码子发生了AAG→TAG突变,使原来编码的赖氨酸被终止密码子取代(K602X);患者6的ABCD1基因第314位密码子发生了GCC→CCC突变,使原来编码的丙氨酸被脯氨酸取代(A314P)。经查阅国内外文献及www.X-ald.nl数据库,其中K602X和A314P突变尚未见报道。 在证实先证者的ABCD1基因突变后,本研究对4个X-ALD高风险胎儿进行产前分子诊断。在妇产科医师的配合下,抽取羊水,提取羊水细胞基因组DNA,采用亲子鉴定试验评估母体基因组DNA污染,用PCR-RFLP、DNA序列测定和DHPLC对胎儿羊水基因组DNA的ABCD1基因进行分析。结果显示:在家系1中,用BcnI切割799bp的PCR产物,胎儿1与其父亲酶切模式一致,PCR产物测序未发现胎儿1的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(P560L突变)。在家系2中, DHPLC分析232bp的PCR产物,胎儿2与其父亲洗脱峰的峰型相似,而与先证者的峰型不同,PCR产物测序未发现胎儿2的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(Q177X突变)。在家系3中,用AciI切割271bp的PCR产物,胎儿3与先证者酶切模式一致,PCR产物测序发现胎儿3的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(R617C突变)。在家系4中,DHPLC分析269bp的PCR产物,胎儿4与其父亲洗脱峰的峰型相似,而与先证者的峰型不同,PCR产物测序未发现胎儿4的ABCD1基因上有与先证者相同的突变(K276E突变)。亲子鉴定试验还显示,胎儿1、2为女性,胎儿3、4为男性;由此推断,胎儿1、2为正常纯合子,胎儿3为ALD半合子,胎儿4为正常半合子。 本研究利用分子克隆技术,从正常人及X-ALD患者(分别带K276E突变和P560L突变)的外周血中提取总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板,自行设计引物,进行ABCD1基因编码区全长的PCR扩增,应用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ消化PCR产物后,与增强型绿色荧光蛋白载体pEGFP-N2连接。将连接产物转化JM109菌株,挑选重组菌,并从中抽提重组质粒。用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切割重组质粒,并对重组质粒插入片段进行序列测定。结果显示,XhoⅠ和EcoRⅠ酶可以从重组质粒切下大小为2253bp片段,与预期相符;一个重组质粒的插入片段与野生型ABCD1基因序列相一致,一个重组质粒插入片段带K276E突变,另一个重组质粒插入片段带P560L突变。将3个重组质粒分别命名为pEGFP-N2-ABCD1、pEGFP-N2-ABCD1(K276E)、pEGFP-N2-ABCD1(P560L)。 通过本研究,建立了X-ALD的分子诊断方法,并在中国人X-ALD患者中发现2个新的ABCD1基因突变,即K602X和A314P突变。提出了一个新的ALD产前分子诊断方案,确保了产前诊断的准确性。成功建构了野生型ABCD1基因及2个突变型ABCD1基因的真核表达载体,为将来研究X-ALD的分子发病机理奠定了基础。


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