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不同剂量~(60)Coγ射线致AHH-1细胞旁效应差异表达基因的研究

杨剑  
【摘要】: 随着核能在国民经济和军事领域中的应用越来越广泛,电离辐射对人类潜在的危害也不断增加。一般认为辐射造成细胞核DNA分子严重损伤,使某些受照体细胞中特定的基因或染色体发生突变,其中涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活或突变、DNA错配损伤修复反应、细胞增殖失控及信号转导通路的改变等因素的综合作用。其机制的研究是电离辐射生物学效应研究的热点和难点之一。值得关注的是,自从国外学者提出电离辐射旁效应概念以来,许多研究者证实旁效应的存在,对“照射细胞核才会引起细胞致命的损伤”“只有受照射细胞才受到损伤”等某些传统观念提出了有力的挑战,辐射诱导的基因不稳定性、细胞质受到照射所致的突变及旁效应等在辐射致癌中同样具有重要作用,并得到放射生物学界的确认。虽然电离辐射旁效应的机制远未了解,但旁效应的发现和研究对于低剂量放射生物效应本质的深入理解及揭示辐射致癌分子机制具有重要的理论意义和实际价值[1-4]。 辐射诱导旁效应(Radiation—induced biologic bystander effect)是指未直接受照射细胞表现出与受照射细胞类似的生物学反应[5-6]。国内外关于旁效应的研究主要集中在两方面:第一是效应研究,包括细胞凋亡或延迟死亡、基因不稳定性、突变、基因表达改变、炎症反应、微核形成以及细胞生长异常等。第二是旁效应机制研究。现有的资料表明旁效应机制是:(1)活性氧作用:用α粒子照射正常人成纤维细胞,发现细胞间O2-、H2O2的产生,并发现膜上还原酶Ⅱ氧化酶在细胞间ROS增高起重要作用。如用抗氧化剂DMSO处理细胞,发现SCE突变量明显降低。由此可见,电离辐射旁效应引起细胞损伤机制至少部分间接地与ROS有关。(2)细胞因子作用:实验证实,低剂量α粒子照射人成纤维细胞的培养基,引起未照射细胞的增殖,并引起照射细胞的上清液中SOD和TGF-β1的浓度增加。另一实验证实,IL-8作为一种信号分子在辐射旁效应中起重要作用。除此之外,线粒体在氧化应激时分泌的凋亡诱导因子(AIF)也可能与电离辐射旁效应有关系。(3)细胞间缝隙连接通讯:研究者认为,照射细胞数量(细胞密度)是辐射旁效应的主要相关参数。可能由于细胞密度大,细胞缝隙连接通讯发生作用,使许多物质释放到培养基而发生旁效应。另外,电离辐射旁效应的细胞间信号传递涉及到能量代谢,其中ATP产生或NAD/NADP减少,可能是辐射旁效应发生的关键。值得注意的是:对于哪类基因在辐射产生的旁效应中起作用直到目前,辐射旁效应及其机制远未了解。 寡核苷酸芯片技术是基于cDNA芯片发展起来的DNA芯片,用于基因表达谱的研究有其独特的优点[7-10],是近年来新发展的一种表达谱检测方法。 本研究利用基因芯片技术对不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞旁效应差异表达基因进行初步研究。 研究内容 1.研究不同剂量60Coγ射线照射人淋巴母细胞(AHH-1)及与其共同培养未照射细胞基因的差异表达。 2.不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞及旁效应细胞FHIT mRNA及蛋白表达变化的研究。 3.不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞及旁效应细胞PTEN mRNA表达变化的研究。 实验方法 1.正常人淋巴母细胞(AHH-1)经0.5Gy和2Gy 60Coγ(0.36Gy/min )射线照射后分别与未照射正常细胞(旁效应细胞)共同培养8h;应用人cDNA芯片对旁效应细胞、直接照射细胞和正常细胞进行检测,分析差异表达基因;选取差异表达1.5倍以上的基因按照生物学过程、分子功能、细胞中组分三大功能进行聚类分析筛选基因。 2.正常人淋巴母细胞(AHH-1)经0.5Gy和2Gy 60Coγ(0.75 Gy/min )射线照射后分别与未照射正常细胞(旁效应细胞)共同培养8h,对FHIT mRNA进行qRT-PCR,Western Blot在分子及蛋白水平进行验证,对PTEN mRNA进行实时荧光定量PCR验证。 3.统计学方法:单样本t检验。 结果 1.发现γ射线照射AHH-1及其旁效应细胞基因存在差异表达;不同剂量直接照射细胞及其旁效应细胞差异表达的基因各不相同;旁效应细胞(0.5Gy)和正常对照组比较:差异表达基因(差异在1.5倍以上)171个,其中上调56个,下调115个;旁效应细胞(2.0Gy)和正常对照组比较:差异表达基因165个,其中上调106个,下调59个;旁效应细胞细胞(0.5Gy)与直接照射细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因226个,其中上调161个,下调65个;旁效应细胞(2.0Gy)与直接照射细胞(2.0Gy)比较:差异表达基因365个,其中上调177个,下调188个;直接照射细胞(2.0Gy)与直接照射细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因397个,其中上调309个,下调88个;旁效应细胞(2.0Gy)与旁效应细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因222个,其中上调197个,下调25个。 经聚类分析后发现:旁效应细胞(0.5Gy)和正常对照组比较:差异表达基因20个;旁效应细胞(2.0Gy)和正常对照组比较:差异表达基因18个;旁效应细胞(0.5Gy)和直接照射组(0.5Gy)比较:差异表达基因12个;旁效应细胞(2.0Gy)和直接照射组(2.0Gy)比较:差异表达基因19个。这些差异表达的基因涉及到信号转导、细胞周期调节、免疫球蛋白、DNA修复等基因。 同时也发现了3个在各个样本中都有变化的基因。另外,热休克60kDa蛋白1(heatshock 60kDa protein 1,HSPD1)基因表达在0.5Gy及2.0Gy旁效应细胞,0.5Gy照射细胞均上调,而在2.0Gy照射细胞中下调。 2.直接照射及旁效应细胞的FHIT基因表达呈下降趋势,但变化不显著(P0.05)。FHIT蛋白表达水平结果表明直接照射及旁效应细胞的FHIT蛋白表达均呈下降趋势,照射剂量为0.5Gy时,其变化不显著;随照射剂量的增加,FHIT蛋白表达下降趋势显著,尤其是照射剂量达2.0Gy以上时,FHIT蛋白表达显著下降,存在比较明显的剂量依赖性。将旁效应细胞与直接照射细胞进行比较,其下降幅度不如直接受照细胞显著。该结果提示:(1)不同剂量60Coγ射线直接照射AHH-1及旁效应细胞FHIT mRNA表达变化不显著。(2)低剂量60Coγ射线(0.5Gy)直接照射及旁效应细胞FHIT蛋白表达变化不显著。(3)较高剂量(2.0Gy-5.0Gy)60Coγ射线均能导致直接照射及旁效应细胞FHIT蛋白表达显著下调,且存在剂量依赖关系,照射剂量越大,其下调越显著。(4)与直接照射细胞共培养的旁效应细胞FHIT蛋白表达表现出与直接照射细胞一致的变化趋势,只是蛋白下调程度不如直接照射细胞明显。该结果再一次证明了电离辐射旁效应的存在。该结果目前未见报道。 3.直接照射及旁效应细胞的PTEN mRNA表达呈下降趋势,其下调程度与照射剂量和细胞的照射方式有一定关系。低剂量照射(0.5Gy)时,其下调较为显著,当照射剂量达2.0Gy时,直接照射及旁效应细胞的PTEN mRNA表达下调不显著(P0.05)。与直接照射细胞相比较,旁效应细胞的PTEN mRNA表达下调更为明显,0.5Gy旁效应细胞的PTEN mRNA表达下调非常显著(P0.01)。提示PTEN基因与低剂量电离辐射生物学效应及电离辐射旁效应的发生存在非常密切关系。该结果目前未见报道。 结论 1.γ射线直接照射细胞可导致与其共同培养的旁效应细胞产生众多差异表达基因,且不同剂量直接照射细胞及与其共同培养细胞差异表达的基因各不相同,提示旁效应的产生与照射剂量有关。 2.旁效应细胞的差异表达基因以下调基因为主,且与信号转导、细胞周期调节、肿瘤发生、DNA修复基因有关。 3.发现一些基因在各剂量组旁效应细胞中均发生变化,提示这些基因的变化可能在一定剂量范围内与照射剂量关系不大。另外少数基因在各剂量组直接照射及旁效应细胞变化趋势相同,提示这些基因的变化在一定剂量范围内与照射剂量及直接或间接照射关系不大。 4.较高剂量(2.0Gy-5.0Gy)60Coγ射线能导致直接照射AHH-1细胞FHIT蛋白表达显著下调,且存在剂量依赖关系,照射剂量越大,其下调越显著。与直接照射细胞共培养的旁效应细胞FHIT蛋白表达表现出与直接照射细胞一致的变化趋势,但其下调幅度不如直接照射细胞。低剂量(0.5Gy)60Coγ射线直接照射及旁效应AHH-1细胞FHIT蛋白表达改变不明显。60Coγ射线直接照射及旁效应AHH-1细胞FHITmRNA表达改变不明显。 5.直接照射及旁效应细胞的PTEN mRNA表达与照射剂量有关,低剂量照射(0.5Gy)时,其下调较为显著。直接照射及旁效应细胞的PTEN mRNA表达和细胞的照射方式有一定关系,旁效应细胞的PTEN mRNA下调更为明显。提示PTEN基因与低剂量电离辐射生物学效应及电离辐射旁效应的发生存在非常密切关系。


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