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TGF-β_1及N-糖组在HBV感染后肝纤维化和肝癌中的研究

赵云鹏  
【摘要】: 乙肝作为世界三大顽症之一,全球乙肝携带者约3.5亿人。在我国,据流行病学调查资料显示,HBsAg阳性者占9.75%,约1.2亿人。其中慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者约2000-3000万人,是我国的常见病与高发病,每年肝病死亡人数约30万人,其中50%为原发性肝癌。由HBV病毒感染引发的肝炎-肝纤维化(硬化)-肝癌这一经典肝病发展模式中,早期肝纤维化具有可逆性,因此针对它的基础研究对控制疾病的诊疗至关重要。目前肝病特别是肝纤维化、肝癌的早期诊断仍是临床一大难题,是肝病实验诊断研究的热点。本课题分为三部分。 (一)致纤维化细胞因子TGF-β1转录调控活性研究 本研究在实验室前期工作的基础上,对致纤维化细胞因子—转化生长因子β_1(Transforming Growth Factor-β_1,TGF-β_1)转录活性的调控机制、转录调控区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)、及抗纤维化细胞因子对含有多态性位点的TGF-β_1基因启动调控序列的作用进行研究。在基因水平探讨TGF-β_1在肝纤维化形成机制中所起的作用及寻找抗纤维化细胞因子作用的靶位点。研究表明,遗传因素在控制TGF-β_1血浆浓度方面发挥着重要的作用。目前已明确人TGF-β_1基因至少存在8个SNPs位点,本实验室前期研究发现:在中国人群仅存在-509(C>T)、codon10(Leu>Pro)的多态性,通过连锁不平衡分析提示,-509C>T和codon10T>C之间存在连锁不平衡,其中-509C>T基因多态性与TGF-β_1血浆浓度有明显的相关性,且与肝纤维化的进度呈正相关。但这些多态性位点是否通过影响TGF-β_1启动子的启动活性发挥作用尚未得到证实。本研究在转录活性调控机制研究的基础上,构建一对含较高转录活性序列的phTGF2.14C/T质粒重组体,探讨多态性对转录启动调控活性的影响。并选用几种具有抗纤维化作用的细胞因子,探讨其对TGF-β_1基因上游-509位点野生/突变型启动调控序列的作用,明确这些抗纤维化细胞因子是否通过影响含-509C>T上游调控序列的TGF-β_1转录活性而发挥作用。结果表明:TGF-β_1基因-509C>T中C等位基因可明显增强TGF-β_1基因上游启动调控序列的转录活性,而IFN-γ作为一种抗纤维化细胞因子在基因转录水平对含有-509C>T野生型/突变型的TGF-β_1基因上游启动调控序列均具有抑制作用。而作为抗纤维化细胞因子的IL-10与HGF在2.14Kb(-1328~+812bp)区域内对TGF-β_1基因上游启动调控序列的作用不显著。 (二)N-糖组血清Profiling在肝病中的应用 如前所述,HBV感染导致的病毒性肝病及其不良结局在我国的高发性已成为严重危害我国人口生存质量的主因之一。但目前肝病(肝纤维化/肝癌)的早期诊断仍是临床一大难题,解决这一难题是从事肝病实验诊断研究者孜孜以求的目标。随着基因组学和蛋白质组学的蓬勃发展,其在肝病的发病机制、早期诊断和治疗中的应用取得一定进展。但是由于慢性肝病肝纤维化、肝癌属于复杂性状疾病、基因之间的相互关系错综复杂、基因变异种类繁多、不同种族人群间存在遗传异质性等原因均为筛选用于慢性肝病诊断的基因变异和差异蛋白增加了困难。所以至今仍未发现能够明确应用于肝纤维化及原发性肝癌诊断的特异基因或蛋白。 随着人类基因组计划的完成及蛋白组技术发展,糖组学研究继而兴起。糖链具有广泛的生物学意义,如影响细胞的发育、分化和形态的维持,参与细胞免疫和细胞间识别,组成血型抗原,作为恶性细胞标记等。同时糖链的这些功能也是其与多种疾病相关的基础,在急性或慢性炎症性疾病,自身免疫病、恶性肿瘤等疾病的发生、发展过程中均可发现糖蛋白的糖链组成或糖基化程度的改变。促进肝纤维化形成的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)主要成分有胶原、糖蛋白和蛋白多糖,除胶原的糖含量不足1%外,其他两类分子的重要组份是糖分子,那么在肝纤维化状态下,这些分子的糖基化水平、糖基化位点、数量等是否存在差异、是否有别于正常肝组织中的细胞外基质成分、是否由此影响其在体内代谢和功能等非常值得关注。血清中,绝大部分糖蛋白是由肝细胞产生,糖分子参与了多种生理、病理条件下细胞的信号传导。由此可见,肝病特别是肝纤维化、原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)情况下,异常糖基化的数量及质量上的变化有望成为这些疾病早期非创伤性诊断的依据。但一直以来,糖组学分析由于存在技术瓶颈,难以在临床研究中采用。如今,一种基于DNA测序仪的荧光毛细管电泳技术为我们提供了简单、快速、高通量检测N-糖链的方法,使血清N-糖链检测运用于肝病临床诊断和预测成为可能。本研究借鉴这一片段分析毛细管电泳技术,分析比较肝病患者血清与正常对照组血清N-糖组图谱,寻找异常峰,为寻求一种新的肝纤维化、HCC诊断标志物奠定基础。结果表明,每份血清均得到至少10个峰的图谱,峰值经校正后量化,肝纤维化、HCC组较对照组均有一些峰存在差异,并具有统计学意义。肝纤维化Peak1、4峰值较对照组升高;peak5、7、8峰值较对照组降低。HCC组Peak1、2、9、11峰值较对照组升高;peak6、8、10峰值较对照组降低,且部分峰值变化与肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、HBVDNA载量、临床肝功能指标存在相关性。上述发现有望成为一种新的非创伤性肝病早期诊断手段。 (三)原发性肝细胞癌(HCC)临床实验室特征分析 HCC虽发病率和死亡率都很高,但其早期诊断一直没有得到很好的解决。尽管近年随着影像学技术的不断进步和治疗水平的不断提高,肝癌的诊断与治疗取得一些实质性的进展,但仍未能使肝癌的诊疗水平有大幅度的提高。因此,提高HCC的早期诊断率一直是从事肝病研究者的努力目标。 本研究通过大样本回顾性研究,对常用血清生化指标、常用肝癌肿瘤标志物、乙肝肝炎病毒标志物、乙肝HBV DNA滴度与肿瘤大小、肿瘤分级的相关性进行研究。结果表明,70.9%的HCC患者伴有不同程度的肝纤维化。HCC患者中肿瘤大小与ALB、GLB、A/G、AST、AST/ALT、GGT、ALP、AFU、AFP、肿瘤分级多项指标有相关性,肿瘤的病理分级(分化程度)与PALB、GGT、肿瘤大小有相关性。总之HCC进展与临床实验室多项生化、肿瘤、病毒指标存在相关性,如果合理应用这些常用的临床指标,并结合目前蛋白组、N-糖组的最新研究发现有望为临床HCC的早期诊断提供有效手段,并最终建立有助于HCC诊断及鉴别诊断的多参数诊断模型,这也是我们下一步研究的目标。 本研究从肝纤维化致病机理出发,从基因水平上寻求主要致病细胞因子与疾病发生发展及治疗的内在联系,继而为后期临床研究奠定基础。我们将糖生物学分析的新技术应用于肝病研究中,旨在发现代表疾病意义的糖分子,为肝病诊断提供一种新方法,并筛选临床常规实验室项目中关系密切的指标,以期为下一步建立有效的HCC多参数诊断模型奠定基础。


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