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TIP30感受细胞氧化应激诱导p53依赖的细胞凋亡机制研究

陈晶晶  
【摘要】: 研究目的 肝脏是人体的主要的解毒器官,代谢十分活跃,肝癌细胞的代谢不仅更为旺盛,而且代谢途径和方式亦有着明显变化。细胞代谢产生的副产物,如活性氧分子簇(Reactive oxygen species,ROS)在细胞的许多死亡途径中充当第二信使的作用,维持了正常细胞的衰老、死亡过程。肿瘤细胞能够逃避这些死亡途径,其抑癌基因的表达失调是重要原因之一。 TIP30,又称CC3或HTIP2,是一个抑癌基因的蛋白产物,能够促进细胞凋亡,在抑制肝癌发生和发展过程中起着重要的作用。晶体结构的分析中TIP30的同源二聚体沿着中心对称轴出现,接触面存在一个由第172位的半胱氨酸形成的二硫键和一个PEG600分子。因为二硫键的变化对于细胞感受自身活性氧的水平的变化和信号传递起到关键作用,在氧化应激的条件下TIP30可能被氧化形成分子间二硫键,执行其抗肿瘤的功能。 基因表达转录后调节的重要性逐渐的被人们所重视。处于信使RNA的3'非翻译区的富含腺嘌呤脲嘧啶元件(AU-rich element,ARE)有着调节信使RNA降解的功能。RNA结合蛋白HuR通过和ARE反式结合,提高信使RNA稳定性或者上调信使RNA稳定性的翻译水平,从而上调基因表达水平。HuR在细胞受到各种刺激时从细胞核向细胞浆中分布转移,发挥对靶向结合的转录物提高稳定性作用。细胞核质转运受体β2(Importinβ2)参与了HuR向细胞核内的转运。最近发现TIP30能够和多种细胞核质转运受体β家族成员结合,抑制核内转运并引起细胞凋亡。因此,TIP30可能通过与细胞核质转运受体β结合的方式调控HuR在细胞内的分布。 我们先前发现TIP30能够通过提高p53的表达水平而诱导细胞凋亡,而提高p53表达水平的方式并不是通过稳定p53蛋白实现的。在本研究中,我们发现在氧化应激条件下TIP30能够以形成二硫键的方式被氧化,导致HuR在细胞浆内的积累和p53信使RNA的稳定,最终诱导线粒体介导的凋亡。 研究方法 ①利用荧光染料2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)检测细胞内活性氧强度。 ②Hoecest 33342染色法检测细胞凋亡。四甲基诺丹明乙酯(TEME)染色法检测细胞凋亡过程中线粒体膜电势的去极化现象。 ③非还原性PAGE电泳和Western blotting蛋白印迹检测蛋白分子分子构象的变化。荧光共振能量传递实验检测活体细胞中蛋白二聚体的形成。 ④Real-time PCR检测基因的信使RNA的表达水平。 ⑤细胞核与细胞浆的分离。 ⑥RNA干扰下调细胞内基因信使RNA的表达。 ⑦通过免疫共沉淀检测蛋白相互作用,蛋白因子与信使RNA的结合。 实验结果 ①感染Ad-TIP30对细胞内活性氧含量高的肝癌HepG2细胞引起细胞死亡,细胞内活性氧含量低的正常肝细胞则几乎不受影响。 ②非还原胶电泳和荧光共振能量传递实验中显示了氧化应激条件下TIP30蛋白二聚体的形成。 ③外源性表达TIP30在氧化应激条件下使得p53信使RNA表达水平上调并增强其转录活性。 ④外源性表达TIP30后引起细胞线粒体膜极性的降低和细胞凋亡,p53缺失或者RNA干扰后表达下调的肝癌细胞系细胞中没有发现此现象。 ⑤在氧化应激条件下外源性表达TIP30后p53信使RNA降解的半衰期显著延长。免疫共沉淀分析中,在外源性TIP30表达的情况下,信使RNA稳定蛋白HuR与p53信使RNA的结合量。 ⑥TIP30在氧化应激的条件下通过和核转运蛋白Importinβ结合诱导HuR在细胞浆内的积累。 研究结论 我们的结果显示TIP30通过提高p53信使RNA的稳定性的方式诱导人肝癌细胞发生凋亡参与了细胞对氧化应激水平的监控。


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