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焦磷酸测序技术在高危型HPV分型中应用的研究

毛静月  
【摘要】: 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属,HPV于1949年由Strauss在电镜下发现,是一种小的环状双链DNA病毒,其基因组长度约8000bp。目前已经确定的HPV亚型有100余种,依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮型HPV,大约30多种型别可感染妇女生殖道,其中约20种与肿瘤相关。依据HPV不同亚型与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型和高危险型HPV,由于不同亚型HPV的致病机制和致癌危险性各不相同,因此对HPV各亚型进行分型检测有重要的临床意义。目前,临床上通过荧光实时PCR技术对HPV进行分型检测,但该方法检测通量低,难以满足临床上同时检测多个亚型的需要,此外通过核酸杂交的方法检测HPV亚型目前在临床广为应用,但其假阴性和假阳性较多,灵敏性和特异性有待提高。在分子诊断领域,最直接而明确的技术是基因测序,传统的基因测序方法是通过Sanger终止法进行的,该方法一次只能读取单个基因的序列,而对于有众多基因亚型感染的疾病,很难获得理想的测序结果。焦磷酸测序技术是近年来发展起来的一种新的序列分析技术,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸,引发酶的级联反应,促使荧光素发光并进行检测,其最大优点是可以实现高通量、高效率并同时检测多至5种以上亚型,对于当前日益增多的混合型HPV感染无疑具有广阔的临床应用前景。 目的:探讨利用焦磷酸测序技术同时检测HPV多个高危亚型的方法,提高HPV及其混合型感染检测的灵敏度和准确度。 方法:设计高度特异的HPV基因亚型测序引物,并对其进行分组;通过高保真PCR获得HPV片段,并进行焦磷酸测序分析。 结果:设计了18个HPV高危亚型的特异测序引物,并对其进行了分组测序,证明对HPV高危亚型的混合感染可以分3组进行测序。 结论:焦磷酸测序技术是一种简便、高效、高通量、高灵敏度、高准确度的HPV分型检测方法。


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