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蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU凋亡的作用及机制研究

孟晓燕  
【摘要】: [背景]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)内在的多药耐药性以及化疗过程中产牛的获得性多药耐药性是HCC化疗失败的主要原因之一。迄今为止仍没有发现用于肝癌化学治疗的有效药物,开发新的化学治疗药物仍然是中晚期肝癌内科治疗领域的热点。蟾酥为我国传统的抗肝癌中药材,以蟾酥为丰治疗肝癌具有非常悠久的历史。本课题组前期的研究发现,蟾酥的有效活性成分--蟾毒灵具有很强的抗肝癌作用,有可能成为克服肝癌多药耐药,治疗中晚期肝癌的有效药物。研究发现蟾毒灵具有抑制耐药细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用,但是其具体机制如何,在体内是否具有相同的作用还值得进一步研究。因此,本课题以人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象,在初步证实蟾毒灵能够抑制肝癌多药耐药细胞增殖的基础上,对其诱导凋亡的作用及机制进行了深入探讨,并对其体内抑制肝癌的作用进行了初步观察。 [目的]研究蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药BEL-7402/5-FU细胞凋亡的作用,并探讨其可能机制。建立人肝癌5-氟尿嘧啶获得性多药耐药裸鼠原位移植瘤模型,评价蟾毒灵对肝癌多药耐药模型的抗肿瘤作用。 [方法] 1蟾毒灵对人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU增殖的影响 MTT法观察蟾毒灵、5-氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素、奥沙利铂、环磷酰胺对人肝癌BEL-7402/5-FU获得性多药耐药细胞株增殖抑制作用。蟾毒灵对亲本及耐药细胞增殖抑制作用的时效、量效关系。 2蟾毒灵诱导耐药细胞株凋亡的作用 光镜观察不同浓度(1、0.1、0.01μM)蟾毒灵作用于人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU 24 h后细胞形态学改变。激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度蟾毒灵(1、0.1、0.01μM)作用24 h后细胞凋亡的特征性荧光分布变化。流式细胞术检测不同浓度蟾毒灵(1、0.1、0.01μM)作用24 h对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株细胞周期及细胞凋亡的作用。 3蟾毒灵诱导耐药细胞凋亡的机制研究 免疫细胞化学和Western blot法检测蟾毒灵对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞Bcl-XL及Bax蛋白表达的影响。流式细胞术检测蟾毒灵作用后,人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株线粒体膜电位的变化与时效关系,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的改变及蟾毒灵对Caspase-9作用的时效-量效关系,并观察Caspase-9特异性抑制剂对蟾毒灵诱导细胞凋亡的影响。 4蟾毒灵对裸鼠人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU原位移植瘤模型的作用 采用“隧道内植入法”建立人肝癌5-氟尿嘧啶获得性多药耐药裸鼠原位移植瘤模型。移植12 d后,挑选肿瘤大小相近的裸鼠,随机分为生理盐水组,氟尿嘧啶组(20 mg/kg·d),蟾毒灵组(1 mg/kg·d)及蟾毒灵(1 mg/kg·d)与5-氟尿嘧啶(20 mg/kg·d)联合用药组(交替给药),给药14 d。治疗结束后采血行肝肾功能及生化检查;游标卡尺测量肿瘤最大径和最小径,计算肿瘤体积;免疫组化法检测生理盐水组TS蛋白表达;HE染色行心、肝、肾组织病理学检查,同时观察肝癌组织病理学改变;TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡率。 [结果] 1人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株对临床常用化疗药5-氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素、奥沙利铂、环磷酰胺的耐药指数分别为:18.66±2.85、10.22±2.85、2.12±0.20、5.91±1.08、8.92±2.46,但对蟾毒灵无明显交叉耐药性,蟾毒灵对人肝癌BEL-7402/5-FU细胞株的增殖抑制作用呈明显的浓度依赖性。 2蟾毒灵处理细胞24 h后可见部分细胞变圆、脱落悬浮于培养液中,细胞体积大小不一,肿胀、固缩的细胞均可见到,细胞内颗粒增多、光密度增强。 3经1、0.1、0.01μM蟾毒灵处理人肝癌BEL-7402/5-FU多药耐药细胞后,G0/G1期细胞分布比例(%)分别为25.58±3.70、48.09±2.49、55.26±1.97,与对照组相比差异均有统计学意义(P0.01),组间比较差异亦有统计学意义(P0.01或P0.05)。G2/M期比例39.78±1.55、32.1±1.14、19.42±1.04,与对照组相比及组间比较差异均具有统计学意义(P0.01)。 4 1、0.1、0.01μM蟾毒灵作用于耐药细胞的凋亡率(%)分别为42.58±2.11、23.27±1.02、18.65±1.36,与对照组比较差异有统计学意义(P0.01);且凋亡率1μM处理组高于0.1μM组(P0.01),0.1μM组高于0.01μM组(P0.01)。 5免疫细胞化学法显示耐药细胞可见Bcl-XL、Bax表达。Western blot显示蟾毒灵组Bcl-XL表达较耐药细胞减少,Bax表达增加。 6蟾毒灵作用后,细胞线粒体膜电位降低(P0.01);随蟾毒灵作用时间延长,线粒体膜电位逐渐降低,6 h与24 h、12 h与24 h组间比较差异有统计学意义(P0.01)。 7蟾毒灵作用后Caspase-3、Caspase-9活性增强,与对照组比较差异有统计学意义(P0.01),加入Caspase广泛阻断剂后,活性减弱(P0.01),而Caspase-8活性未见明显变化(P0.05)。蟾毒灵作用6、12、24 h后Caspase-9活性均增强,并在24 h内呈明显的时间、浓度依赖性。 8蟾毒灵处理后,细胞凋亡率为(25.37±3.16)%,高于对照组(P0.01);Caspase-9特异性抑制剂组细胞凋亡率为(10.59±2.29)%,低于蟾毒灵组(P0.01),与空白对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。 9蟾毒灵对裸鼠原位移植瘤的影响 多药耐药裸鼠原位移植瘤模型瘤组织的耐药蛋白TS呈高水平表达。蟾毒灵组肿瘤体积与生理盐水组比较差异有统计学意义(P0.01),蟾毒灵联合5-氟尿嘧啶组与蟾毒灵组比较差异有统计学意义(P0.05);Tunel法肿瘤组织细胞凋亡率的检测显示,5-氟尿嘧啶组细胞凋亡率为(8.70±3.21)%与生理盐水组(5.49±2.53)%比较差异无统计学意义(P0.05),蟾毒灵组为(29.79±4.54)%及联合用药组(45.63±5.50)%均高于生理盐水组(P0.01),蟾毒灵组高于5-氟尿嘧啶组(P0.01),联合用药组高于蟾毒灵组(P0.01)。肝肾功能、生化指标蟾毒灵组与生理盐水组比较差异无统计学意义(P0.05),5-氟尿嘧啶组与生理盐水组比较AST及CL~-、K~+水平差异有统计学意义(P0.01)。 [结论] 1、人肝癌多药耐药BEL-7402/5-FU细胞株对蟾毒灵无明显的交叉耐药性,蟾毒灵对其具有增殖抑制作用;蟾毒灵对裸鼠原位移植瘤的生长具有显著的抑制作用,对裸鼠心肝肾等脏器无明显毒副作用。2、蟾毒灵能诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU细胞凋亡;3、增加促凋亡蛋白Bax表达、降低抗凋亡蛋白Bcl-XL表达,促进线粒体膜电位耗散继而活化Caspase-9可能是蟾毒灵诱导人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU凋亡的机制之一。


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