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pEGFP-IRES-BDNF转染BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤

张清港  
【摘要】: 背景: 脊髓损伤(spinal cord injuries,SCI)是现在交通、工矿事故、运动意外以及战伤中常见的损伤,伤者多为青壮年,损伤造成的截瘫不仅严重影响患者的身心健康,而且给家庭和社会造成巨大的经济、人力和精神负担。长期以来脊髓损伤的修复一直是困扰人类健康的难题,也是世界各国科学家们致力于研究的焦点,但目前缺少切实可行的有效治疗方法。 胚胎干细胞、神经干细胞和嗅鞘细胞移植是目前研究的热点,但是都存在组织来源缺乏、伦理学及免疫排斥等问题,而自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可以解决上述问题。 BMSCs作为一种多潜能干细胞对中枢神经系统损伤或外伤等造成的功能丧失治疗作用显著,具有与其它细胞来源无法比拟的优势:(1)获取方便,可从患者本人骨髓取材;(2)可在体外快速培养扩增,并定向诱导分化;(3)在宿主组织中可长期生存并进行整合;(4)通过自体移植可避开免疫排斥反应;(5)可进行基因工程技术加工;(6)能以多种途径包括静脉注射、中枢神经损伤处不同部位进行细胞移植。因此,BMSCs是一种理想的细胞来源,为神经系统疾病的细胞和基因治疗提供了新的思路和广阔前景。 脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)为神经生长因子(NGF)家族的第二个成员。BDNF对多巴胺能神经元、胆碱能神经元等多种神经元都有广泛作用,能促进干细胞更多的向神经元样细胞分化。局部注射神经营养因子,有一定的危险性,并且不能长久维持较长时间的高浓度。全身静脉应用,剂量必然需要大大增加,而中枢神经系统解剖结构的特殊性使外源性给药利用率不高,同时由于局部微循环破坏而达不到治疗浓度。这就要求采用一种能使神经营养因子长久维持在损伤局部的高浓度释放的方法。 BDNF基因转染BMSCs,BMSCs可以反复传代扩增,分泌大量的神经生长因子,并且诱导BMSCs向神经系细胞分化,从而为脊髓损伤的干细胞移植治疗及神经营养因子基因治疗探索一种新的切实可行的可能具有突破性的方法。目的: 1、探讨密度梯度离心和差速贴壁法对BMSCs的体外分离、纯化、培养,研究BMSCs的增殖、分化以及免疫学等生物学特性。 2、探索BDNF、GFP共表达质粒的构建与转染BMSCs方法,以及BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP的生物学特性。 3、探讨BMSCs、BMSCs-GFP、BMSCs-BDNF-GFP与DRG经Transwell共培养的方法,及对DRG轴突生长的促进作用。 4、评价BMSCs-BDNF-GFP移植治疗大鼠脊髓损伤的作用。 方法: 第一部分选用6周龄SD大鼠,采用Ficoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的BMSCs,通过反复传代培养差速贴壁法使之纯化,获得的细胞纯度高,生物性状稳定,增殖能力强的细胞株。并重点地观察了BMSCs形态变化、细胞活性、细胞生长曲线、表面免疫标记物检测以及细胞的成骨诱导分化能力等。 第二部分主要研究从大鼠胎脑组织中获取BDNF序列,构建BDNF和GFP共表达重组质粒pEGFP-IRES2-BDNF,lipofectamine 2000介导转染BMSCs,获得同时稳定高效表达BDNF和GFP的BMSCs-BDNF-EGFP。ELISA等方法研究BMSCs-BDNF-EGFP的生物学特性。 第三部分取孕期14d的胎鼠的背根神经节,建立体外胚胎大鼠背根神经节的分离培养及纯化体系,并通过0.4μm的Transwell小室胎鼠行DRG与BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP共培养,通过倒置相差显微镜及免疫组化观察其对DRG轴突生长的促进作用,验证细胞活性。 第四部分动物分组和损伤模型的制备及处理:制备大鼠脊髓半切损伤动物模型,分别行生理盐水、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP移植。实验结果的观测:(1)行为学观测:BBB评分;(2)动物灌注,脊髓切片;(3)免疫组织化学分析(4)BDA顺行追踪。 统计学分析。 结果: 1、密度梯度离心和差速贴壁法分离纯化的BMSCs经生物学及流式细胞仪表面标记物鉴定,活细胞率为95~100%,纯度99%;诱导培养后碱性磷酸酶染色阳性,钙结节染色阳性。 2、成功构建BDNF和GFP共表达质粒,并成功转染BMSCs,获得的BMSCs-BDNF-EGFP增强表达BDNF,是正常细胞的20,000倍。 3、胎鼠的DRG通过Transwell培养板与BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP共培养,BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促进DRG的轴突生长,BMSCs-BDNF-EGFP更明显。 4、BMSCs、BMSCs-EGFP、BMSCs-BDNF-EGFP促进大鼠脊髓损伤的修复,BMSCs-BDNF-EGFP效果更显著。 结论: 1、密度梯度离心和差速贴壁法是一种很好的分离纯化BMSCs的方法。 2、pEGFP-IRES2-BDNF使BDNF和GFP两个基因在一个载体中的同一个启动子下协同高效表达。 3、BMSCs-BDNF-EGFP能明显促进DRG轴突生长。 4、BMSCs-BDNF-EGFP能显著促进大鼠脊髓损伤恢复,是脊髓损伤的干细胞移植治疗理想的细胞来源和神经营养因子基因治疗的理想的细胞载体。


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