收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

肾脏局部病理改变和肾小管上皮细胞受损在肾结石形成中的作用及其机制研究

陈书尚  
【摘要】: 一、研究目的 1、通过观察不同结石成分肾结石患者肾乳头的组织病理学特点和钙盐沉积特点,分析局部病理改变与钙盐沉着在肾结石形成中的作用;通过检测成骨性蛋白骨桥蛋白、骨形成蛋白-2(BMP-2)和Ⅱ型胶原在肾结石患者肾组织的表达,以验证我们关于。肾结石患者肾组织钙盐沉积的形成可能也是一种成骨性反应的猜测,探讨肾钙盐沉积的机制; 2、通过观察不同浓度草酸、COM结晶对体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)的毒性损伤和蛋白表达的影响,探讨上皮细胞受损在肾结石形成过程中的可能作用; 3、通过双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定HK-2细胞在受到草酸、COM结晶损伤后表达的差异蛋白质,并推测和讨论这些蛋白质在HK-2细胞受损和肾结石形成中的可能作用,为进一步深入研究肾结石的形成机制提供新的研究思路和方向。 二、研究内容 1、采用傅立叶转换红外光谱测定结石成分;对接受经皮肾镜取石碎石术(PCNL术)的肾结石患者,于术中直视下获取肾乳头活检标本,行HE染色和茜素红染色,光镜和电镜下观察其组织病理学特点;采用免疫组化检测骨桥蛋白、BMP-2和Ⅱ型胶原在肾结石患者肾组织的表达情况,并与正常肾组织比较。 2、体外培养HK-2细胞,待细胞长满后,换成无血清含钙DMEM培养液,使细胞处于静止期;分别在培养基中加入不同终浓度(1 mM、2 mM、3 mM、5 mM和10mM)草酸、(200mg/L、500mg/L和1000mg/L)COM结晶或(1 mM、2 mM、3 mM、5 mM和10mM)草酸+200mg/L COM结晶,作用4h、12h及24h后,以CCK-8试剂盒检测上述结石成分对HK-2细胞的毒性作用;通过Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测HK-2细胞受不同浓度(1 mM、2 mM、5 mM和10mM)草酸或(1mM、2mM、5mM和10mM)草酸+200mg/L COM结晶作用后,细胞表达的总蛋白量的变化。 3、筛选受草酸和COM结晶损伤后HK-2细胞的差异蛋白表达谱:利用双向凝胶电泳技术对正常HK-2细胞和与2mM草酸+200mg/L COM结晶共孵育12小时后的HK-2细胞总蛋白进行电泳分离,获得相应蛋白质谱。Image Master Platinum5.0图形分析软件对凝胶图谱进行分析,筛选出正常HK-2细胞和与草酸+COM结晶孵育后细胞间的差异蛋白质点。 4、使用Finnigan线性离子阱串联质谱仪(LTQ)对部分差异表达蛋白点进行液相色谱—串联质谱分析(LC-ESI-MS/MS);从所鉴定出来的差异蛋白点选择2种蛋白ENO1和Cofilin-1,用Western blotting验证其在正常HK-2细胞和受损HK-2细胞中的表达情况;通过检索数据库,对所鉴定出来的蛋白质进行亚细胞定位和功能分析,并对这些蛋白在肾小管上皮细胞受损和肾结石形成中的可能作用进行推测和讨论。 三、结果 1、部分肾结石患者的肾脏可见肾乳头钙斑;活检标本的组织病理学检查发现局部有钙盐沉积。钙盐沉积的镜下特点:在钙盐聚集较多的组织切片,钙盐镜下表现为结节状或片状,可见于肾小管基底膜和间质组织;而在钙盐较少的组织标本,钙盐仅见于肾小管基底膜,或呈颗粒状由肾小管基底膜向间质蔓延;当钙盐突破尿路上皮进入集合系统后,其上可见小结石生长。 免疫组织化学检查表明:肾结石患者肾组织中的肾小管上皮细胞可见骨桥蛋白呈阳性表达,而肾结石患者肾组织和正常肾组织均未见BMP-2和Ⅱ型胶原明显表达。 2、细胞毒性检测表明,草酸和/或COM结晶对HK-2的毒性作用呈明显浓度依赖性,但在不同的浓度与作用时间对HK-2作用不同。蛋白含量检测表明:1mM、2mM和5 mM草酸作用12h后,HK-2表达的蛋白量增加,但无统计学意义(P均>0.05);而受10mM草酸或10mM草酸+200mg/L COM结晶作用12h后,HK-2表达的蛋白量则显著减少(分别为263.75±75.77ug/ml vs 328.75±60.34ug/ml,227.5±54.97ug/ml vs328.75±60.34ug/ml,P<0.05);2mM草酸+200mg/L COM结晶作用12h后,HK-2表达的蛋白量稍高于正常HK-2细胞,但无统计学意义(332.5±51.48ug/ml vs328.75±60.34ug/ml,P>0.05)。 3、成功建立正常HK-2细胞和受2mM草酸+200mg/L COM结晶作用12小时后的HK-2细胞总蛋白的双向凝胶电泳图谱,实验组凝胶最后共得到2204±84个蛋白点,正常细胞组即对照组最后共得到2347±57个蛋白点。经软件分析,实验组凝胶与对照组凝胶比较共找到可信差异表达蛋白点16个。其中实验组表达上调的有9个,表达下调的有7个。 4、差异蛋白点利用LC-ESI-MS/MS技术进行了质谱鉴定,最后共有12个蛋白质点得到了鉴定。有许多研究表明这些蛋白参与了细胞的能量代谢、细胞增殖、凋亡、钙离子通道活性调控、细胞运动及信号转导等多种生理功能。Western blotting检测证实了受损HK-2细胞中ENO1蛋白表达升高,而Cofilin-1表达降低。 四、结论 1、肾结石患者钙盐沉积最初可能形成于肾小管基底膜,并向间质扩展。钙盐在肾结石形成中至少起到了以下作用:①钙盐突破上皮进入集合系统,可作为结晶粘附、聚集和生长的平台;②脱落到集合系统的钙盐可作为结石形成的核心;③钙盐与局部细胞相互作用,影响肾结石的形成。 2、肾结石患者肾组织表达骨桥蛋白,而不表达BMP-2和Ⅱ型胶原,因此钙盐的形成可能并不是一种类似于动脉钙化的成骨性反应。 3、草酸、COM结晶在不同的浓度与作用时间对HK-2细胞产生不同程度的毒性作用。 4、高浓度草酸和COM结晶可使正常人HK-2细胞的蛋白表达发生改变,这些蛋白的功能涉及能量代谢、细胞增殖和凋亡、细胞运动、钙离子通道活性调节、信号转导、蛋白合成调节和细胞应激反应等多方面,既可起到细胞的自我保护作用,又可能通过相应途径在肾结石的形成过程中起重要作用,对这些蛋白与肾结石关系的进一步探讨,有望发现影响肾结石形成的新的作用途径和机制 5、本研究将双向凝胶电泳结合蛋白质谱分析应用于尿路结石的基础研究,为了解尿石结晶与上皮细胞的相互作用、研究肾结石形成机制和寻找预防肾结石发生和复发的有效措施提供了新的方法和研究方向。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 程国翔,顾可梁,黄明元;尿细胞管型的组织化学染色及鉴别方法[J];临床检验杂志;1991年02期
2 郑丰;黎磊石;;大黄对体外肾小管细胞增殖的影响[J];医学研究生学报;1991年04期
3 喻陆;肾小管上皮细胞分离方法与原代培养[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1995年06期
4 王东,吴雄飞,金锡御;大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及传代[J];中华实验外科杂志;1999年02期
5 蔡锦全;欧良明;王庆华;林荣禧;谭建明;陈子宣;洪佳平;林文洪;;血清可溶性细胞间粘附分子-1测定在肾移植急性排斥反应中的临床意义[J];福州总医院学报;1999年03期
6 邹贵勉,张璟,周飞舟;TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1的表达[J];中国血液净化;2005年07期
7 李开龙,王建民,丁涵露,赵玲,宋瑞华,陈林;p21对缺血-再灌注损伤后肾小管上皮细胞演变的影响[J];中国危重病急救医学;2005年10期
8 张聪;董鸿瑞;谌贻璞;;慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞转分化与肾间质纤维化的关系[J];中华肾脏病杂志;2006年01期
9 童延清;候火明;朴志贤;;马兜铃酸肾病的发病机制[J];国际泌尿系统杂志;2006年02期
10 赵宗江;梁凯峰;谷海瑛;;复方鳖甲软肝方对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞增殖的影响[J];世界科学技术-中医药现代化;2006年01期
11 韩敬;张璟;;人肾小管上皮细胞在转化生长因子β_1诱导下桩蛋白表达研究[J];第三军医大学学报;2006年10期
12 姚敏;王瑞英;王绵;苏胜偶;;罗格列酮对2型糖尿病大鼠肾小管的保护作用[J];中国糖尿病杂志;2006年03期
13 张爱青;甘卫华;陈荣华;潘晓勤;费莉;;IGF-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化相关基因表达的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2006年10期
14 张白玉;毛海萍;李志坚;李志莲;安欣;尹培达;余学清;;Smac/Diablo与X-连锁凋亡抑制蛋白在ATP耗竭再恢复诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用[J];中华肾脏病杂志;2006年11期
15 张爱青;甘卫华;陈荣华;潘晓勤;费莉;;胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成的作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2007年02期
16 王巍巍;张金元;;促红细胞生成素对马兜铃酸致肾小管上皮细胞损伤保护作用的初步观察[J];中国中西医结合肾病杂志;2007年03期
17 刘伦志;宁建平;;大黄酸对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞表型转化的影响[J];内科急危重症杂志;2007年01期
18 易著文;;评价肾小管间质功能在防治肾脏病中的意义[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2007年05期
19 王美云;陈玉琼;张志坚;端礼荣;;脂多糖对人肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖和细胞因子表达的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2007年11期
20 张静敏;徐辉;张秀云;;过量氟对大鼠肾组织碱性成纤维细胞生长因子表达的影响[J];中国地方病防治杂志;2007年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张海燕;姜宗培;常洁;朱恒梅;余学清;;NADPH氧化酶在TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质积聚中的作用[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
2 樊均明;甘华山;杨宁;王宏天;李文斌;王燕翔;;阿魏酸钠对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
3 周建华;张瑜;;MHBs~(t167)对肾小管上皮细胞膜结合型补体调节蛋白表达的影响及意义[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年
4 王巍巍;张金元;;马兜铃酸对肾小管上皮细胞凋亡信号蛋白caspase-3、Bcl-xL表达的影响及rHuEP0的干预作用研究[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年
5 谭玉莉;黄妍;杨亦彬;;鱼胆汁毒素致肾小管上皮细胞死亡方式及实施干预的试验研究[A];贵州省医学会肾脏病学分会2008年学术年会论文汇编[C];2008年
6 武彦平;赵宗江;张新雪;;肾康注射液对肾小管上皮细胞LLC-PK_1分泌层粘连蛋白的影响[A];中医药现代化研究学术大会论文集[C];2001年
7 刘维萍;陈香美;洪权;吴镝;吕杨;刘书馨;傅博;许国双;;Connexin43抑制肾小管上皮细胞转分化作用的研究[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
8 赵班;郑法雷;吴华;李慧凛;刘建春;;MCP-1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用及其与ILK表达的关系[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
9 尤莉;陈靖;杨海春;顾勇;郝传明;;分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin在肾小管上皮细胞转分化中表达的研究[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年
10 罗健华;;TIMP-1过表达对肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制研究[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李丽;PAX2基因沉默在梗阻性肾病肾小管上皮细胞转分化中作用机制的研究[D];中国医科大学;2010年
2 王光兰;IL-1β诱导肾小管上皮细胞转分化及其与细胞骨架的关系[D];吉林大学;2010年
3 何春梅;血管内皮生长因子(VEGF)对肾小管上皮—间充质细胞转化的作用及机制探讨[D];中国协和医科大学;2007年
4 谢恺庆;C-反应蛋白在慢性肾脏病进展中的作用及机制的研究[D];南方医科大学;2010年
5 何玉华;肾康注射液对白蛋白诱导活化的肾小管上皮细胞表型转化的实验研究[D];成都中医药大学;2005年
6 汤珣;siRNA抑制CTGF表达对高糖诱导肾小管上皮细胞肥大和转分化的影响及机制[D];南方医科大学;2009年
7 聂静;衔接蛋白p66Shc对糖尿病肾病肾小管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响与机制研究[D];中南大学;2009年
8 宁建平;肾小管上皮细胞转分化在DN发病中的作用及大黄酸对其影响的研究[D];中南大学;2007年
9 唐荣;Klotho基因在高血压肾损害肾小管上皮细胞凋亡中的作用及冬虫夏草对其的影响[D];中南大学;2009年
10 裴秀丛;镉对肾小管上皮细胞E-cadherin影响及氯丙嗪和异搏定对镉毒性影响的研究[D];中国医科大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曲矿云;大黄酸对转化生长因子β_1诱导的肾小管上皮细胞转分化及核因子κB活性的影响[D];兰州大学;2007年
2 马琳娜;高糖对肾小管上皮细胞表达RANTES、TGF-β的影响及霉酚酸干预研究[D];苏州大学;2007年
3 陈艳杰;CD40信号激活对肾小管上皮细胞的影响[D];苏州大学;2007年
4 沈琼;高糖环境中肾小管上皮细胞RANTES、CCR5的表达及辛伐他汀干预研究[D];苏州大学;2008年
5 陈丽叶;高糖对肾小管上皮细胞MCP-1、ICAM-1、NF-κB和FN的影响及疏血通的干预作用[D];苏州大学;2008年
6 吴嫚;尾加压素II异常表达与人肾纤维化关系的初步探讨[D];兰州大学;2008年
7 王阳;改构型酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素诱导的大鼠肾小管上皮细胞损伤的预防作用[D];广西医科大学;2010年
8 欧善际;草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞骨桥蛋白表达的影响[D];吉林大学;2011年
9 向华;新生山羊肾小管上皮细胞分离培养及永生化的研究[D];西北农林科技大学;2011年
10 李勤;干扰素-γ对转化生长因子-β1诱导肾小管上皮细胞转分化及结缔组织生长因子表达的作用[D];四川大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;环孢素A对鼠肾小管上皮细胞的毒性作用[N];中国医药报;2003年
2 陈金伟;与牛黄解毒片不能同服的药(二)[N];大众卫生报;2009年
3 副主任医师 魏开敏;为何肾脏易受药物损害[N];医药养生保健报;2004年
4 黄显斌 唐明山;我国“非典”病理研究获重要进展[N];中国医药报;2003年
5 汪敏;基因诊断遗传性高血压获成功[N];健康报;2000年
6 魏民;尿沉渣检查都查啥[N];农村医药报(汉);2003年
7 邓跃林;肖桂林;鱼胆中毒致MODS的临床研究[N];中国医药报;2004年
8 邓伯勋;尿样镜检出现管型的临床意义[N];中国中医药报;2004年
9 魏开敏;药物面前:肾脏最易受伤[N];大众卫生报;2004年
10 解放军总医院全军肾脏病研究所教授 吴镝王继荣 刘泉 整理;推进肾病科研的四大利器[N];健康报;2008年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978