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重组人促红细胞生成素模拟缺血预适应改善大鼠肠系膜缺血再灌注损伤

李晓凯  
【摘要】: 研究背景 1960年,Jenings首先提出缺血再灌注损伤的概念,发现许多组织、器官缺血后恢复血液再灌注,其功能障碍和结构损伤进一步加重,这种现象即为缺血再灌注损伤。机体内许多组织器官,如心、脑、肝、肾、胃肠、肢体等都可发生缺血再灌注损伤。小肠是对缺血缺氧极其敏感的器官之一。肠系膜缺血再灌注事件在严重创伤、失血性休克、感染性休克、肠系膜动脉栓塞和血栓形成、肠系膜静脉血栓形成、肠绞窄、腹主动脉瘤修补以及小肠移植等临床情况中有重要的意义。近年研究还发现,在CO2气腹造成的高腹压状态下,小肠有缺血再灌注样损伤;小肠的缺血再灌注损伤还影响小肠及结肠吻合口的愈合;肠系膜缺血再灌注还促进术后肠粘连的发生,而术后肠粘连是肠梗阻的首要病因。肠系膜缺血再灌注事件对小肠的局部损伤表现为肠功能衰竭:肠动力障碍、肠消化吸收功能障碍及肠屏障功能障碍,进而可导致肠道菌群移位和内毒素血症,肠源性炎症介质释放,放大炎症瀑布反应,诱发全身炎症反应综合征,损伤肝、肺、肾等远处器官,最终可导致多器官功能障碍综合征和多脏器衰竭,而肠系膜缺血再灌注事件是MOF发生发展过程中的枢纽和始动环节。因此,肠缺血再灌注事件损伤机制及防治策略的研究有着重要的临床意义。 1986年,Murry等首先提出了缺血预适应(Ischemia Preconditioning,IPC)的概念,即短期缺血应激能使组织器官对随后更长时间缺血再灌注损伤产生明显的保护作用。之后进行的体内及体外实验的研究发现,心、脑、肾等容易发生缺血缺氧损伤的器官普遍存在IPC现象。IPC是机体对于缺血缺氧而产生的一种内源性保护机制,同时又能作为一种干预手段而减轻缺血再灌注损伤。IPC对于心肌细胞、神经细胞的有益作用已较为肯定,对其保护效应的机制也有了较深的认识和了解,特别是在心肌缺血再灌注损伤的研究中,已有不少实验证实了一些介导IPC效应的内源性保护因素,NO、腺苷、内源性阿片样肽等物质在不同器官缺血再灌注损伤的动物模型中表现出模拟IPC的效应。IPC的机制十分复杂,尚未完全阐明,以往对IPC在小肠缺血再灌注损伤中的作用及机制研究不多,IPC对小肠缺血再灌注损伤的保护作用尚未完全确立。 近年来,促红细胞生成素的非造血生物活性成为研究的热点。传统观念认为,EPO是一种糖蛋白造血细胞生长因子,主要由肾脏合成和分泌,具有促进红系干细胞增殖、分化、成熟,促进网织红细胞释放入血的生物学作用。重组人促红rHuEPO问世以来,临床上广泛应用于肾性贫血、恶性肿瘤患者放化疗导致的贫血并取得了良好的疗效。EPO对心肌、脑、肾等器官缺血再灌注损伤的保护作用逐渐受到关注,这些研究表明,EPO可能具有抗炎、抗氧化等组织保护作用。然而,目前EPO对肠缺血再灌注损伤的效应尚未明确。 目的 1.利用大鼠IPC模型观察IPC在小肠缺血再灌注损伤中的作用,并对其效应机制进行初步的探讨 2.利用大鼠肠系膜缺血再灌注损伤模型,观察给予rHuEPO对小肠缺血再灌注损伤的影响,并探讨介导其效应的机制 方法 1.采用肠系膜上动脉无创性暂时阻断30min,之后恢复肠系膜血流再灌注60min的方法构建大鼠肠系膜缺血再灌注损伤模型,采用2周期的5min缺血/5min再灌注建立大鼠肠系膜IPC模型 2.心室穿刺取血制备血清样本,以四乙氧基丙烷作为标准品,通过硫代巴比妥酸反应方法来测定血清丙二醛含量,评价缺血再灌注损伤诱导的脂质过氧化水平 3.取大鼠远端回肠制备肠组织匀浆样本,比色法测定样本髓过氧化物酶活性,评价缺血再灌注损伤诱导的炎症反应程度 4.大鼠远端回肠组织切片,苏木素-伊红染色,采用Park/Chiu对肠组织损伤程度进行组织病理学评分;TUNEL法测定肠粘膜凋亡细胞数 5.采用Western blot方法检测大鼠远端回肠组织样本Bcl-2表达 结果 1.重组人促红细胞生成素的实验研究模型中,与假手术组对比,缺血再灌注组大鼠血清MDA含量显著增高(8.42±0.08 vs 2.62±0.10nmol/ml,P0.01),而促红素组大鼠血清MDA含量显著低于缺血再灌注组大鼠血清MDA水平(4.70±0.11 vs 8.42±0.08nmol/ml,P0.01)。与假手术组对比,缺血再灌注组大鼠肠组织MPO活性显著增高(2.04±0.04 vs 0.18±0.04U/g湿组织,P0.01)。而促红素处理组大鼠肠组织MPO活性显著低于缺血再灌注组大鼠肠组织MPO水平(0.56±0.07 vs 2.04±0.04U/g湿组织,P0.01)。假手术组大鼠没有观察到明显的肠粘膜损伤;缺血再灌注组大鼠肠粘膜表现出较为显著的组织病理学损伤,绒毛剥脱,上皮层和固有层大量分离,从绒毛尖端开始向浆膜层进展,毛细血管扩张充血;促红素处理组大鼠肠粘膜损伤显著减轻,仅有轻度的上皮下间隙形成,较轻微的上皮层从固有层分离及毛细血管充血。其肠粘膜结构得以较好的保存,显微镜下没有观察到固有层崩解、上皮脱落等较为严重的粘膜损伤证据。假手术组大鼠肠组织病理学评分较低(0.33±0.21),与假手术组对比,缺血再灌注组大鼠肠组织病理学评分显著升高(3±0.26 vs 0.33±0.21,P=0.003)。与缺血再灌注组对比,促红素处理组大鼠肠组织病理学评分显著降低(1.33±0.33 vs 3±0.26, P=0.006)。采用双变量直线回归分析Chiu评分与血清MDA含量相关性,二者之间表现出显著的线性正相关。其直线回归方程为Y=0.294+7.532X,决定系数R2=0.837,相关系数r=0.915,P=0.010;同样采用双变量直线回归分析Chiu评分与MPO活性相关性,二者之间也同样表现出显著的线性正相关。其直线回归方程为Y=1.599+0.148X,决定系数R2=0.817,相关系数r=0.904,P=0.013。假手术组大鼠回肠粘膜细胞很少凋亡(3.67±0.62)。与假手术组对比,缺血再灌注组大鼠TUNEL阳性细胞数显著增多(24.67±2.28 vs 3.67±0.62,P0.01),表明大鼠肠缺血30min再灌注60min之后诱导出现明显的粘膜细胞凋亡。而促红素处理组大鼠TUNEL阳性细胞数则显著低于缺血再灌注组水平(11.0±1.07 vs 24.67±2.28,P0.01)。采用非参数Spearman秩相关分析方法,显示缺血再灌注损伤大鼠组织病理学Chiu评分与肠粘膜凋亡细胞数之间有正相关关系,Spearman等级相关系数rs=0.845,P0.05。 2.缺血预适应的实验研究模型中,缺血预适应组大鼠血清MDA含量显著低于缺血再灌注组大鼠血清MDA水平(5.50±0.14 vs 8.42±0.08nmol/ml,P0.01)。格列苯脲组大鼠血清MDA含量显著高于假手术组(8.22±0.10 vs 2.62±0.10nmol/ml,P0.01),而与缺血再灌注组无显著差异(8.22±0.10 vs 8.42±0.08nmol/ml,P0.05)。缺血预适应处理组大鼠肠组织MPO活性显著低于缺血再灌注组大鼠肠组织MPO活性(0.73±0.06 vs 2.04±0.04U/g湿组织,P0.01),格列苯脲组大鼠肠组织MPO活性显著高于假手术组(1.97±0.06 vs 0.18±0.04 U/g湿组织,P0.01),而与缺血再灌注组无显著差异(1.97±0.06 vs 2.04±0.04 U/g湿组织,P0.05)。缺血预适应处理组大鼠肠粘膜损伤较轻,仅有轻度的上皮下间隙形成,较轻微的上皮层从固有层分离及毛细血管充血,表现类似于促红细胞生成素组,肠粘膜结构得以较好的保存,显微镜下没有观察到绒毛剥脱,固有层崩解,溃疡,出血,大片上皮下间隙等表现,比较类似于促红素处理的镜下。格列苯脲组大鼠肠粘膜损伤较重,绒毛结构完整性破坏,绒毛剥脱,上皮下间隙扩大,并沿绒毛两侧向深层扩展,固有层裂解可见,绒毛结构完整性损害,表现类似于缺血再灌注组。缺血预适应处理组大鼠肠组织病理学评分显著低于缺血再灌注组(1.50±0.34 vs 3±0.26, P=0.014)。格列苯脲组与缺血再灌注组大鼠肠组织病理学评分无显著差异(2.67±0.33 vs 3±0.26, P=0.38);与假手术组对比,格列苯脲组大鼠肠组织病理学评分显著升高(2.67±0.33 vs 0.33±0.21, P=0.003)。缺血预适应处理组大鼠TUNEL阳性细胞数显著低于缺血再灌注组水平(12.0±1.16 vs 24.67±2.28,P0.01),而格列苯脲组大鼠TUNEL阳性细胞数与缺血再灌注组无显著差异(22.83±1.35 vs 24.67±2.28,P0.05);与假手术组对比,格列苯脲组大鼠TUNEL阳性细胞数显著增多(22.83±1.35 vs 3.67±0.62,P0.01)。假手术组大鼠回肠组织样本Bcl-2蛋白微弱表达,缺血再灌注组、IPC组及格列苯脲组大鼠回肠组织样本Bcl-2蛋白表达明显增强,其中,IPC组Bcl-2蛋白的表达最强。 结论 1.预适应性缺血减轻大鼠肠系膜缺血再灌注诱导的氧化应激损伤,减轻肠组织中性粒细胞积聚,抑制肠粘膜细胞凋亡,KATP通道阻滞剂阻断预适应性缺血的保护效应,因此推测IPC的肠组织保护效应与KATP通道有关。 2.EPO可能通过其抗氧化、抗炎、抗凋亡效应从而减轻大鼠肠缺血再灌注损伤,EPO模拟IPC的肠组织保护效应。


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