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抗HBs Fab-IFNα对HBV感染作用的实验研究

陆慧琦  
【摘要】: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生,是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一。尽管目前有核苷类药物和干扰素等抗乙型肝炎病毒制剂,但缺乏切实有效的长期应答效应以及受个体耐药等因素的制约,故慢性HBV感染的治疗仍然是目前面临的一道难题。 IFNα因其能抑制HBV-DNA的复制,常被用作治疗病毒感染的抗病毒药物。有研究报道,在慢性肝炎携带者中IFNα治疗有效性仅为30%,其中约有50%的患者在停止治疗后可出现复发。为了达到抗病毒效果,药物剂量常要加大几倍、几十倍,药物剂量的加大也加重了其不良反应,又容易产生干扰素抗体,从而影响疗效,限制了其在临床的广泛应用。我们通过将抗乙肝表面抗原抗体Fab片段与IFNα在分子水平上进行重组,并制备了重组的融合蛋白( anti-HBs Fab-IFNα),以期通过抗体与干扰素的双重作用,实现感染细胞水平上的抗病毒性肝炎的生物导向治疗。 第一部分人源性抗HBs Fab和IFNα融合蛋白的原核表达 基于前序制备的人源化抗HBs-Fab抗体具有免疫学活性,这部分实验的目的是构建和表达人源性抗-HBs Fab和IFNα融合蛋白。以pBAD IFNα质粒为模板,根据IFNα基因序列结构设计引物,在引物5’和3’端加入XbaI的酶切位点和含有5个氨基酸的连接肽序列。依据PCR产物两端所引入的限制性内切酶,以相同的酶分别酶切PCR产物和pBAD Fab载体,以T4连接酶连接。连接产物转化Top10大肠杆菌后,挑取单菌落增菌,经测序和PCR鉴定,筛选阳性克隆。 挑取正确插入的转化菌落,于100ml含Amp的LB培养基中生长,以阿拉伯糖诱导表达。表达上清经Ni-NTA柱纯化、浓缩后,12%的SDS-PAGE电泳并转印至硝酸纤维素膜上,经封闭后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG Fab反应,于25Kd和47.5Kd处可见明显蛋白区带,推测47.5Kd的区带为λ和IFNα的融合蛋白,25Kd处为重链的Fd段。Western blot和HBsAg特异性Dot blot结果表明融合蛋白中的轻链具有较好的抗原结合活性,IFNα活性达4.2×103~ 4.85×104IU/ml。 第二部分人源性抗-HBsλ和IFNα融合蛋白的真核表达 巴斯德毕赤酵母具有真核表达系统的诸多优点,可对表达的蛋白进行翻译后的加工、折叠与修饰,从而使表达出的蛋白具有生物活性;与其他真核表达系统相比,既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点;且能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源。在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内,又可分泌到胞外,自身分泌的蛋白非常少,十分有利于纯化。 将目的片段克隆到pPICZαC载体的AOX1启动子基因后,分离纯化质粒DNA,PCR、测序鉴定。将重组质粒以BstX I内切酶线性化,经电穿孔方法将质粒转化入X33菌株,在Zeocin浓度为100μg/ml的转化平板上挑取转化子,进行小规模培养。 培养上清中的λ-IFNα用BrCN-sepherose 4B柱纯化,纯化后的重组蛋白经SDS- PAGE电泳,表达蛋白的分子量约为50Kd,略大于其在原核中表达的分子量,用ELISA法检测融合蛋白IFNα的抗原性及其抗体亲和力,用WISH细胞检测IFNα生物学活性,证实融合蛋白既具有与抗HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素活性,干扰素活性达到7.8×104 ~5.1×105 IU/ml,高于原核表达系统(p0.01);Western blot和HBsAg特异性Dot blot结果也表明表达产物具有较好的抗原结合活性。 第三部分抗HBsλ-IFNα对HBV感染作用的实验研究 目前体外研究HBV感染是以HBV基因组转染肝癌细胞作为细胞模型,HepG 2.2.15就是以HBV基因组转染HepG2而建立的。HepG2.2.15呈现持续表达HBV,并被证明在其培养上清中可检测到HBsAg, HBeAg和HBV DNA颗粒的释放。HBV DNA含量为1.2×105~3.7×105拷贝/ml,HBsAg浓度为16.2~ 20.5 COI(正常参考值为1.0 COI),HBeAg浓度为230~320 Ncu/L(正常参考值为30 Ncu/L)。HepG 2.2.15可以作为探索HBV病原体与宿主的相互作用的工具,是评估抗HBV新药的良好模型。 用于研究的λ-IFNα是含有人抗HBsλ抗体片段与IFNα的融合蛋白。本实验旨在比较IFNα和λ-IFNα两种不同的制剂对HepG2.2.15细胞的作用,检测细胞培养上清中病毒释放的HBV-DNA和抗原含量。分别收集培养9天的HepG 2.2.15细胞及上清,以ELISA法检测HBsAg和HBeAg的含量,以荧光定量PCR法检测病毒载量,融合蛋白的细胞毒性用MTT法进行检测。 Fas是细胞表面重要的介导凋亡的受体,是细胞凋亡的信号分子。Fas与配体FasL结合,活化并传导凋亡信号,是诱导细胞凋亡的重要途径,在机体的免疫监视过程中起重要作用。凋亡抑制是肿瘤细胞的基本特征之一,因此肿瘤细胞抵抗Fas介导的凋亡,可能是肿瘤细胞免疫逃逸的机制之一。本实验通过对HepG2.2.15细胞系Fas的表达及功能进行检测,了解重组蛋白λ-INFα对肝癌细胞凋亡的影响。 实验结果显示,经过9天的连续培养,λ-IFNα各个浓度组均能降低细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的含量,且随时间的延长和药物浓度的增高,其作用也随之增强(P0.05),而λ-IFNα和IFNα组间的抑制作用差异无统计学意义(P0.05)。同时在细胞毒性实验中,λ-IFNα最高浓度组对细胞的毒性与阳性对照组差异无统计学意义(P 0.05)。2 IU/ml、10 IU/ml浓度的λ-IFNα对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率差异无显著性(P0.05),20 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml浓度的λ-IFNα对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率有显著差异(P0.05),λ-IFNα对HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的抑制率高于同浓度的IFNα(P0.05)。提示通过抗体片段的运载,使IFNα更易或更多的与靶细胞表面的IFNα受体结合,从而更有效发挥IFNα抗HBV效果。 HepG2.2.15细胞低表达Fas蛋白,经λ-IFNα处理后Fas表达增加。HepG2.2.15能抵抗Fas介导的凋亡,Fas激活抗体CH11不能诱导HepG2.2.15的凋亡。HepG 2.2.15经λ-IFNα处理后可上调Fas的表达,CH11能诱导其凋亡的发生(p0.05)。 越来越多的证据证明体液免疫是保护机体免受HBV感染的重要途径。总之,本研究证实在体外抗HBsλ-IFNα能中和HBV病毒分泌的HBsAg,降低HBV- DNA的载量,其作用优于IFNα。同时λ-IFNα能上调HepG2.2.15细胞的Fas表达,促进CH11介导的凋亡。抗HBsλ-IFNα抗体在体外实验中显示了有效的中和病毒的作用,为今后的动物实验奠定了基础。


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