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芦笋质量控制的现代分析方法研究

姜云云  
【摘要】: 芦笋是百合科天门冬属植物,是世界十大名菜之一,味道鲜美、营养丰富,并具有很好的保健功效。研究表明,芦笋具有多种药理活性,如抗肿瘤、降血脂、增强免疫力、抗衰老、抗疲劳和保护肝脏等。目前,对芦笋化学成分的研究较少,仅停留在总黄酮和总皂苷的初步分离纯化上,因此,尚无法对芦笋进行全面有效的质量控制。本论文首先对芦笋的营养成分进行了较为全面的质量控制,然后对芦笋中的化学成分进行分离鉴定,并对芦笋黄酮部位进行富集纯化并作定量分析,再通过二维柱切换液相色谱法分离制备了芦笋中五种黄酮苷,并采用全二维液相色谱法对芦笋黄酮部位进行了分析,考察了各成分与脂质体膜之间的相互作用,最后对所得五种黄酮苷和芦笋黄酮部位进行了体外抗氧化活性研究,初步揭示并验证了芦笋发挥药理活性的物质基础和黄酮抗氧化活性的构效关系。 一、芦笋中营养成分的质量控制 1、氨基酸在pH5.5时与茚三酮反应形成蓝紫色化合物,颜色的深浅与溶液中氨基酸的含量成正比,且在570nm处有最大吸收,利用此原理,测定该波长处的吸光度即可计算氨基酸浓度。本实验以L-谷氨酸为标准品对方法学进行了全面考察,线性回归方程为A=0.0073C-0.1133(r=0.9998),线性范围30.30-151.50μg/mL,样品经显色反应后在1.5h小时内稳定,精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的鲜芦笋样品中总游离氨基酸含量为17.43-22.43‰。 2、考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,在稀酸中与蛋白质结合变成蓝色,最大吸收波长也从465nm变成595nm,蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,因此,可以根据此原理测定蛋白质含量。本实验以牛血清白蛋白为标准品对方法学进行了全面的考察,线性回归方程为A=0.0077C+0.0524(r=0.9996),线性范围19.80-99.00μg/mL,样品经显色反应后在1.5h小时内稳定,精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的鲜芦笋样品中总蛋白质含量为1.08-1.69‰。 3、芦笋中总多糖的含量测定采用的是硫酸蒽酮显色法,以葡萄糖为标准品,线性方程为A=0.0081C+0.0907(r=0.9990),线性范围20.00-100.00μg/mL,样品经显色反应后在1.5h小时内稳定,精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的干燥芦笋样品中总多糖含量为1.16-1.64%。 4、选择AQC为衍生化试剂,以普通C18柱作为分离载体,建立了芦笋水解氨基酸的指纹图谱,确定了16个共有峰,鉴定了其中的11个氨基酸,并在指纹图谱条件的基础上测定了10批芦笋中11种氨基酸的含量,结果如下:组氨酸2.97-5.56‰,甘氨酸0.39-0.53‰,天冬氨酸1.64-3.63‰,谷氨酸0.89-1.55‰,苏氨酸0.32-0.46‰,丙氨酸0.32-0.57‰,胱氨酸0.47-1.01‰,酪氨酸0.23-0.28‰,缬氨酸0.36-0.65‰,亮氨酸0.37-0.60‰,苯丙氨酸0.35-0.44‰。 二、芦笋的化学成分研究 1、芦笋中两种嘌呤类化合物的分离制备 干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱,收集20%乙醇洗脱流分,再经葡聚糖凝胶柱脱色,纯化后的样品采用制备液相色谱法分离,得到两种嘌呤类化合物,经1HNMR和13CNMR鉴定为9-(2-甲硫基-3-磺酸基-4-羟基)-呋喃-6-氨基-嘌呤和腺苷。 2、芦笋中五个黄酮类化合物的分离制备 干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱,收集40%乙醇洗脱流分,再经葡聚糖凝胶柱脱色,纯化后的样品采用制备液相色谱法分离,得到五种黄酮苷,经HPLC-DAD-MS鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷。 3、芦笋中一种有机酸的分离制备 干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱,收集60%乙醇洗脱流分,再经葡聚糖凝胶柱纯化,即得纯品,经1HNMR和13CNMR鉴定为肉桂酸。 三、芦笋黄酮部位的制备与定量分析 1、干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱(60×4cm),先静止吸附1h,再分别用水1500mL、20%乙醇2000mL和40%乙醇2000mL依次洗脱。收集40%乙醇部分并于50℃减压浓缩至干,加30%甲醇溶解后,过Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶柱(100×3cm),分别用300mL水、200mL50%甲醇和1000mL甲醇依次洗脱,收集含黄酮的流分,合并后于50℃减压浓缩至干,即得芦笋黄酮部位。 2、采用紫外分光光度法,以芦丁为标准品,测定了芦笋黄酮部位中总黄酮含量,并对方法学作了详细考察,线性回归方程为A=0.0024C-0.0174 (r=0.9992),线性范围62.00-310.00μg/mL,样品经显色反应后在1.5h小时内稳定,精密度、重现性和回收率结果均符合要求。所测三批样品中总黄酮的含量均高于50%。 3、采用高效液相色谱法测定了芦笋黄酮部位中槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷的含量,色谱条件如下:色谱柱为Diamonsil○R (钻石)C18柱(200×4.6mm,5μm)(Dikma Technologies),流动相:乙腈-甲醇-0.1%醋酸水(8﹕16﹕76),流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长260nm,进样量20μL,方法学考察结果符合要求。测定三批样品中槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷的含量分别为11.26-12.62%, 22.64-24.78%, 4.37-5.09%, 4.13-4.89%,3.22-3.63%。 四、芦笋中黄酮苷单体的二维色谱法制备及芦笋黄酮部位的全二维液相色谱分析 1、采用二维柱切换液相色谱分离制备了芦笋中五种黄酮苷单体(槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷),该系统维间切换没有用到定量环,而是用六通切换阀取而代之,这样可以确保组分被全部切换进入第二维,避免了样品损失,且切换体积不受定量环限制。与普通的一维制备液相色谱法相比,该法可以大大提高分离效率,并节约有机溶剂用量。 2、采用HSCCC-PHPLC二维方法从芦笋黄酮粗品中分离制备了五个黄酮苷单体(槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷)。该方法中,HSCCC作为一种预处理手段,分离得到两个含目标成分的流分,继而通过制备液相色谱进一步分离得到高纯度的目标化合物。该法避免了繁琐的样品柱色谱预处理过程,具有操作简便、制备效率高等优点。 3、采用全二维液相色谱法分析了芦笋黄酮部位,第一维采用的是脂质体柱(250×4.6mm,5μm,自制),流动相为10mmol/L pH 7.4的醋酸铵缓冲液,流速0.1mL/min;第二维采用Chromolith Performance RP-18e (100×4.6mm)整体柱,流动相采用A:乙腈,B:10%乙腈梯度洗脱,0-2min 3%A,2-4min 3%A-17% A,4-4.5min,17% A -3%A,4.5-5.0min,3%A,流速3.0 mL/min。通过考察芦笋中不同成分在脂质体柱上的色谱行为,可以判断各成分与脂质体膜之间的相互作用强弱,从而推断药物在生物体内的ADME。 五、芦笋总黄酮及其黄酮苷单体体外抗氧化活性研究 以VitC为阳性对照药物,系统研究了芦笋总黄酮及其黄酮苷单体的体外抗氧化活性。结果表明,芦笋中的黄酮苷单体有较强的抗氧化活性:能明显清除·OH和O2-,对DPPH自由基也有较强的清楚作用,具有较强的抑制大鼠红细胞氧化溶血的作用。芦笋总黄酮也有相应的体外抗氧化活性,强度与总黄酮含量相关。本实验验证并揭示了芦笋发挥多种药理活性的物质基础和黄酮类化合物抗氧化活性的构效关系。 综上所述,本论文以芦笋的质量控制为目的,建立了总游离氨基酸、总蛋白质和总多糖三大营养成分的定量分析方法,建立了芦笋水解氨基酸的指纹图谱并对其中11种氨基酸作了定量分析。为了进一步了解芦笋发挥药理活性的物质基础,本论文对芦笋的化学成分作了初步研究,首次从芦笋中分离出两种嘌呤类化合物、五种黄酮苷和一种有机酸。建立了芦笋黄酮部位的制备方法和定量分析方法,为今后进一步开发芦笋黄酮打下了基础。本论文还建立了芦笋中五种黄酮苷的二维柱切换液相色谱制备方法和HSCCC-PHPLC二维制备方法,与传统制备液相色谱法相比,这两种方法具有制备效率高、溶剂消耗少等优点。本论文采用全二维液相色谱法分离分析了芦笋黄酮部位,考察了芦笋中不同成分与脂质体膜之间的相互作用。最后,本论文对芦笋黄酮部位和芦笋中五种黄酮苷的体外抗氧化活性作了系统考察,验证并揭示了芦笋发挥药理活性的物质基础和黄酮类化合物抗氧化活性的构效关系。


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1 李锡杰;师硕;王旭;;生物电信号的滤波与现代分析方法[J];医学信息;2005年12期
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