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大鼠体外多器官细胞共培养模型的建立及在纳米物质毒性研究中的应用

许桂凤  
【摘要】: 遵循“4R”原则,发展基于细胞的体外毒性测试方法是近年来毒理学方法学研究的主要发展趋势和研究热点。目前,在毒理学体外毒性试验方法中存在的主要问题,一是培养的是单一细胞,只能评价毒物对单一细胞的特定作用,而毒物在体内对器官的作用有选择性,对各个器官细胞的易感性和毒作用可能并不都相同;二是多数毒物在体内需经代谢转化解毒或活化成毒性代谢产物,机体的代谢可在肝脏和/或其它器官进行;而目前采用肝S9作为代谢活化系统不足以模拟体内的实际状况。这些问题是可能导致体内外毒性观察结果不一致,阻碍体外毒性试验难以成为安全性评价方法的主要原因。新近提出的多器官细胞共培养方法有可能在一定程度上解决上述问题。此外,纳米物质由于其尺寸和特殊的理化性质,目前还难以直接定量测定环境和生物系统中纳米物质的含量,需要研究新的毒性研究方法;而多器官细胞共培养方法在研究纳米物质的代谢动力学、靶器官毒性和细胞内的动力学特征方面可能具有某些优势。为此,本研究的目的是建立大鼠体外多器官细胞共培养方法;探讨建立大鼠体外多器官细胞共培养方法作为毒性靶器官筛选或研究模型的可能性;将所建模型初步应用于在纳米物质的毒性研究。 方法:1.采用胶原酶消化法、支气管灌洗分离法、两步消化法等方法分离大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞,用单层贴壁法分别培养;采用飞片法,将五种细胞的飞片放入同一培养皿,用10%FBS DMEM作为培养基建立多器官细胞共培养方法。2.大鼠体外多器官细胞共培养作为靶器官毒性研究模型的初步研究:以已知毒性的四氯化碳、氟化钠、二氧化硅、氯化镉、醋酸铅为毒物,验证其靶器官效应。用MTT法检测细胞毒性;用生物化学方法检测培养液中特异生化指标的变化如:检测培养液中谷丙转氨酶(ALT)、大鼠促红细胞生成素(EPO)、大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)、大鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量。3.在此基础上,初步应用于纳米TiO2和单壁碳纳米管的研究。 结果:1.建立的大鼠原代肝细胞、肾细胞、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、真皮成纤维细胞分离方法稳定,台盼兰染色法检测细胞分离成活率达90%左右,细胞生长状态良好。2.大鼠五种原代细胞组成的多器官细胞共培养方法结果显示,五种原代细胞在共培养时细胞生长增殖情况良好,单独培养与共培养细胞生长曲线基本重合。3.本试验结果显示,四氯化碳根据IC50值对这五种细胞的毒性从大到小依次为:肝细胞肺泡巨噬细胞心肌细胞肾细胞真皮成纤维细胞;CCL4对肝细胞的剂量--反应曲线变化趋势明显不同于其它细胞;从引起生化指标改变起始浓度中最敏感的是指标是ALT和cTn-I。氟化钠根据IC50值对五种细胞的毒性从大到小依次为:肾细胞肺泡巨噬细胞心肌细胞肝细胞真皮成纤维细胞;NaF对肾细胞的剂量--反应曲线变化趋势明显不同于其它细胞;从引起生化指标改变起始浓度中最敏感的指标是Epo和cTn-I。氯化镉根据IC50值对五种细胞的毒性从大到小依次为:肾细胞心肌细胞肺泡巨噬细胞肝细胞真皮成纤维细胞;从引起生化指标改变起始浓度中最敏感的指标是Epo,均表明肾细胞是氯化镉最敏感的毒作用靶细胞。但从剂量--反应曲线变化趋势各种细胞比较近似,而且对五种细胞的毒性均较大,IC50也相近,提示氯化镉对多种靶细胞都有毒性。二氧化硅根据IC50值对五种细胞的毒性从大到小依次为:肺泡巨噬细胞心肌细胞肝细胞真皮成纤维细胞肾细胞,肺泡巨噬细胞的剂量--反应曲线变化趋势明显不同于其它细胞,从引起生化指标改变起始浓度中最敏感的指标是MIP-2。醋酸铅根据IC50值对五种细胞的毒性从大到小依次为:肺泡巨噬细胞心肌细胞真皮成纤维细胞肾细胞肝细胞。醋酸铅对各种细胞毒性的剂量--反应曲线变化趋势和IC50相近,肺泡巨噬细胞相对较敏感,与上述其它毒物的毒作用特征相比似无特别敏感的靶细胞。从引起生化指标改变起始浓度中最敏感的指标是cTn-I。4.纳米二氧化钛的毒性大于常规尺度的TiO2;随着纳米二氧化钛的尺寸变小,其对各器官细胞毒性增大;常规尺度TiO2的主要靶器官可能是肺和心脏,纳米TiO2提示随着纳米尺度的变小,损伤的靶器官可能增多;单壁碳纳米管毒性大于常态碳黑颗粒;两者的靶器官有可能不同,碳黑颗粒的靶器官可能是肺和心脏,单壁碳纳米管可能有多个靶器官。 结论: 1.首次建立了大鼠多器官细胞共培养方法。 2.大鼠多器官细胞共培养方法可作为毒性靶器官的研究模型,通过多器官细胞共培养模型将检测细胞毒性和其特异性指标的结合,可有效的识别出化学物的靶器官毒性。但上述研究结果是初步的,对于多器官细胞共培养的器官、毒性评价指标及标准等均有待于优化、验证。 3.纳米二氧化钛和单壁碳纳米管的毒性分别大于常规尺度的TiO2和碳黑颗粒纳米二氧化钛和单壁碳纳米管的靶器官可能与常规尺度的TiO2和碳黑颗粒有所不同,纳米物质比常规尺度物质的毒作用靶器官多,而且随着纳米尺度的变小,损伤的靶器官可能增多,尚有待进一步研究证实。大鼠多器官细胞共培养模型有望成为揭示纳米材料毒作用特征的一个新方法。


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