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脓毒症患者血小板蛋白质组学的研究

刘骥  
【摘要】: 【目的】 脓毒症的早期诊断有助于采取更为恰当的治疗措施以改善脓毒症患者的预后,但目前仍缺乏有效的预测手段。本研究应用双向电泳和生物质谱鉴定的差异蛋白质组学方法寻找脓毒症患者血小板中差异表达蛋白,并对这些差异表达蛋白分子进行进一步的研究和筛选,以期寻找到脓毒症相关的血小板特异性蛋白标志物,同时进一步明确脓毒症血小板蛋白质组病理生理变化的分子机制,以便早期采取积极措施以改善脓毒症预后。 【方法】 新鲜血液采集自十日内未用过任何药物的正常健康受试者以及脓毒症确诊24 h的脓毒症患者,每份血样都单独处理,加入体积比10%的枸橼酸钠抗凝在室温下200g离心20 min获得富血小板血浆(PRP)。取PRP的上三分之一入新试管加入最终浓度为2.5mM的前列环素,1000g离心10min。去除血浆后,用Tyrodes-HEPES液洗涤吹悬血小板至浓度2×108/ml,室温下孵育30min,15000g离心裂解血小板后加入20 l蛋白酶抑制剂,-80°C冻存。利用固相pH梯度及SDS-PAGE二维凝胶电泳分离PLT总蛋白,考马斯亮蓝染色、Imagescanner扫描、PDQuest软件图像分析找出差异表达蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-TOF)及Mascot查询软件、SwissPort数据库鉴定差异表达蛋白。 【结果】 1.优化获得了重复性和分辨率较好的正常健康受试者及脓毒症患者血小板蛋白质组双向凝胶电泳(2-DE)图谱。 2.建立了正常健康受试者与脓毒症患者血小板2-DE差异表达图谱。 3.采用质谱法鉴定了2-DE图谱上的差异蛋白质点,通过MALDI-TOF-MS检测和蛋白质数据库搜寻,成功鉴定了6个蛋白质点,分别为来自细胞骨架蛋白家族的Actin, cytoplasmic 1;信号转导通路蛋白家族的IL-1β、EF-hand calcium-bindingdomain-containing protein 7;膜受体蛋白家族的GPⅨ、GPⅡb/Ⅲa和翻译后加工蛋白Protein disulfide-isomerase A3。 【结论】 脓毒症后血小板蛋白质组与正常受试者相比差异显著。应用基于2-DE和质谱分析的蛋白质组学方法可全面了解血小板蛋白质组变化规律,采用差异蛋白质组学成功鉴定了脓毒症血小板蛋白质组中6个差异表达蛋白,这些蛋白包括细胞骨架蛋白家族、信号转导通路蛋白家族、膜受体蛋白家族、翻译后加工蛋白。提示联合应用2-DE和MS技术的蛋白质组学在在筛查脓毒症临床诊断标志物方面是一个强有力的工具,有望用于临床。


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