VEGF、FGF-2低频超声透皮给药系统对猪超长筋膜瓣应用的初步研究

【摘要】： 研究背景 在战伤和日常常见的创伤中,贯通伤、离断伤、皮肤撕脱伤、严重烧伤等组织缺损创面非常常见,早期良好的组织覆盖是修复的关键,也是野战外科和整形外科的重要研究课题。筋膜皮瓣是临床上软组织缺损修复中最常用的一种皮瓣类型,但由于其没有知名动脉供血、静脉系统相对表浅的特点,躯干部位皮瓣的长宽比例通常不能超过2.5～3:1的范围,否则皮瓣远端易出现缺血坏死或静脉回流障碍,从而限制了其临床应用和推广。如何提高超长宽比例筋膜皮瓣的成活率是目前研究的热点。目前,分别利用血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)或成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)在促进缺血皮瓣的成活,带蒂皮瓣的提前断蒂,加强皮瓣的延迟效应,缩短扩张皮瓣的周期和抗术后回缩等实验中已找到确切的作用。VEGF主要促进毛细血管生成,而FGF-2则主要促进小动脉的形成。研究发现VEGF、FGF-2之间具有协同促进作用,VEGF是FGF-2发挥作用的基础,同时FGF-2又可以促进VEGF的表达,联合应用可使两者差异性互补,显著增强促血管生成作用。同等条件下,体外培养的血管内皮细胞在两者联合应用时其细胞增殖数目比单用任何一种时多2～8倍。目前联合用药的临床应用尚处于初步试验阶段,研究空间和临床应用价值较大。低频超声介导下的经皮给药(Ultrasound-Mediated Transdermal Drug Transport,UMTDT)是一种无创的给药方法,可避免或减轻全身用药的不良反应,并可避免局部注射给药带来的肿痛等副作用。在皮瓣末梢血运不良的情况下,静脉用药或口服给药无法使药物及时有效地到达缺血部位,UMTDT可使促血管生成药物直接到达缺血部位,以较少量的药物在局部达到并维持有效血药浓度,加速缺血部位的血管化,从而达到促进皮瓣缺血部分愈合的作用。 目的 应用VEGF和FGF-2,以透皮低频超声导入的无创给药方法,验证单用一种药物与联合用药对猪超长宽比例筋膜皮瓣成活率及微循环的影响,为扩大超长宽比例筋膜皮瓣临床应用奠定实验基础。 材料与方法 选用10只实验用猪。在实验猪背部两侧对称设计3cm×15cm的筋膜皮瓣,方向与躯干纵轴垂直,每侧分成五组,分组如下:A空白超声对照组,予低频超声处理;B低频超声经皮导入VEGF组;C低频超声经皮导入FGF-2组;D注射VEGF、FGF-2联用组,于缺血部位多点注射,一日三次;E低频超声经皮导入VEGF、FGF-2联用组。低频超声使用功率为20kHz/3W/cm2,15min/次,一日三次。自手术之日起各组按设计连续处理5天。术后每日观察皮瓣颜色、质地、温度、术后肿胀情况等。于术后第10天后对皮瓣的成活情况做出判断,将皮瓣照片输入计算机,应用计算机图形分析仪,测量皮瓣成活面积。测量后切取组织标本,10%福尔马林液固定,常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察组织学变化。利用计算机全自动图像分析系统测量出每1cm2组织中毛细血管密度。对切片行相应抗体免疫组化荧光染色,测定阳性表达的面积的光密度(OD值),计算阳性指数=阳性面积×OD值,最终对阳性指数进行统计学分析,对标本中的VEGF和FGF-2进行定量定性分析。 结果 1.大体观察:五组中,大体观察A组坏死面积最大,B、C两组次之,D、E组远端坏死面积小于B、C两组,且E组坏死范围最小。 2.皮瓣成活面积和成活率:A组平均成活面积为(25.90±2.60)cm2,B组平均成活面积为(34.99±2.91)cm2,C组平均成活面积为(34.58±4.13)cm2,D组平均成活面积为(37.39±4.01cm)2, E组平均成活面积为(40.02±3.33)cm2。A组平均成活率为(57.55±5.78)%,B组平均成活率为(77.76±6.47)%,C组平均成活率为(76.85±9.18)%,D组平均成活率为(83.08±8.91)%, E组平均成活率为(88.93±7.41)%。成活面积和成活率F=47.45,P0.001,总体存在显著差异。进一步分析:各实验组(B、C、D、E)皮瓣成活面积和成活率均明显高于对照组(A),(P0.001);单独超声给药组(B、C)两组间无显著差异(P=0.708);联用注射给药组(D)和联用超声给药组(E)明显高于单独超声给药组(B、C),(P0.05);联合用药组群(D+E)明显高于其他各组(P0.001),且联用超声给药组(E)较联用注射给药组D更高(P0.05)。 3.毛细血管密度:在超长宽比例皮瓣的近1/3段,各组间毛细血管密度无显著差异(P=0.071)。在中1/3段,各实验组密度均高于对照组(A),(P0.001);单独超声给药组(B、C)两组之间密度无差异(P=0.990);联用注射给药组(D)和联用超声给药组(E)毛细血管密度明显高于单独超声给药组(B、C),(P0.05);联合用药组群(D+E)密度明显高于其他各组(P0.001),但组群内两组间密度无显著差异(P=0.059)。在远1/3段,对照组(A)基本未成活,数据缺如;两种单独超声给药组(B、C)之间毛细血管密度无显著差异(P=0.323);联合用药组群(D+E)密度明显高于其他各组(P0.001);联用注射给药组(D)密度高于VEGF单独超声给药组(B)(P0.05),但与FGF-2单独超声给药组(C)间密度无显著差异,(P=0.064);联用超声给药组(E)毛细血管密度明显高于其他各组(P0.001)。 4免疫组化荧光染色 VEGF阳性指数:实验组各组(B、C、D、E)均高于对照组,(P0.001);单独超声给药组(B、C)两组药物之间无显著差异(P=0.060);联用注射给药组(D)和联用超声给药组(E)高于单独超声给药组(B、C)(P0.001),且联用超声给药组(E)较联用注射给药组(D)更高(P0.001)。 FGF-2阳性指数:实验组各组(B、C、D、E)均高于对照组,(P0.001);单独超声给药组(B、C)两组药物之间无显著差异(P=0.263);联用注射给药组(D)和联用超声给药组(E)高于单独超声给药组(B、C)(P0.001),且联用超声给药组(E)较联用注射给药组(D)更高(P0.001)。 结论 经过实验研究,统计学分析,可得出以下结论: 1.在筋膜皮瓣的缺血部位,通过VEGF和FGF-2在局部经皮低频超声应用,可显著提高皮瓣的毛细血管密度;两种药物联合应用能够使缺血部位的毛细血管密度进一步提高。 2.VEGF和FGF-2单独在局部应用可以显著的提高二者的表达,且相互之间存在协同、促进作用。二者经注射或低频超声给药共同应用可以进一步提高阳性表达,且通过低频超声导入给药可延长给药时间,有利于维持有效血药浓度,使阳性表达更高。 3.VEGF和FGF-2经皮单独低频超声介导给药应用于猪超长宽比例筋膜皮瓣,可显著提高皮瓣的成活率;两种药物联合应用注射给药或经皮低频超声给药能够进一步促进皮瓣的成活,且经皮低频超声给药较注射给药成活率更高。