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Sal等中药有效成分在氧化应激中的保护作用

霍文静  
【摘要】: 【目的】 氧化应激与过氧化物积聚是导致多种疾病(如脑缺血、Alzheimer’s病(AD)、脑动脉粥样硬化等)的根本原因。H_2O_2是氧化应激反应密切相关的活性氧之一,其主要产物OH-具有很强的氧化性并可自由进入细胞,破坏细胞内活性氧和抗氧化代谢的平衡,使抗氧化酶等活性下降,同时会损伤体内脂质、蛋白质和DNA等生物大分子,造成细胞内酶活力变化、代谢紊乱、DNA损伤和细胞调亡。机体自身具有清除或修复氧化损伤的能力,例如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是机体内重要的抗氧化酶系之一,其作用在于清除体内的自由基。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1, APE/Ref-1)是一种多功能的蛋白,在DNA碱基切除修复(BER, base excise repair)、对转录因子的氧化还原调控和活性氧簇的调控等多个重要的生物学过程中发挥着重要的作用,是参与DNA氧化损伤修复的重要抗氧化酶。因此,提高机体氧化损伤时抗氧化酶的表达/活性将有利于对上述疾病的预防及治疗。 近年来研究表明,我国很多中药成分具有抗氧化、改善血液流变学等对人体有利的作用,但其抗氧化作用机制目前仍在研究之中。本文建立了用于筛选抗氧化药物的细胞模型,对几十种中药有效成份进行筛选,并对中药红景天的主要成分红景天甙(Salidroside,Sal)的抗氧化应激作用及其机制进行了初步的实验观察与分析,对APE/Ref-1的表达与过氧化氢导致PC12细胞损伤的关系进行研究,为氧化应激损伤引起的老年性心血管系统、神经系统疾病的预防和治疗提供理论依据。 【方法】 1.抗氧化药物筛选模型的建立:用PC12细胞,以不同的浓度H_2O_2(设0,50,100,200,300,400μM)孵育细胞1h及用200μM H_2O_2分别作用30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h,然后采用MTT比色法进行细胞存活检测。选用维生素E为抗氧化应激阳性对照药物,建立细胞模型,用于抗氧化药物的筛选。 2.抗氧化中药药物成分的筛选:运用所建立的细胞抗氧化模型,先用不同浓度的中药药物成分与PC12细胞共孵育30 min,再加入终浓度为200μM的H_2O_2作用1小时,对50种中药成分进行抗氧化保护作用的筛选。 3.红景天甙的抗氧化损伤保护作用及其机制探讨:选择其中抗氧化作用较为明显的中药红景天的提取物红景天甙,对其抗氧化保护作用进行进一步探讨。红景天甙抗氧化作用的作用机制如何?我们猜测,红景天甙的抗氧化保护作用在细胞水平可能与提高细胞对氧化损伤的耐受性、减轻细胞受损、和促进细胞增殖有关。为探讨其保护作用机制,实验选用1,10,100μM三个浓度的红景天甙对PC12细胞进行预处理30 min,设正常对照组和氧化损伤组(加入终浓度为200μM的H_2O_2作用1h),通过MTT、细胞形态学观察及台盼蓝染色等方法,观察其抗氧化损伤作用,通过BrdU掺入后流式细胞仪检测细胞增殖情况,并用Western Blot方法观察细胞内APE/Ref-1的表达变化,分析红景天甙抗氧化损伤作用的可能机制。 【结果】 1.MTT法检测试PC12细胞进行H_2O_2氧化损伤处理情况,实验发现处理1 h后,200,300,400μM H_2O_2可以引发细胞损伤,细胞存活出现明显降低,其损伤程度呈现浓度依赖性;用200μM H_2O_2处理后,细胞损伤呈时间依赖性变化。阳性对照药物维生素E可以减轻氧化引发的细胞损伤,并具有剂量依赖性,由此成功建立抗氧化损伤的筛药模型。 2.采用上一步建立的PC12细胞模型,将不同浓度的药物与PC12细胞共孵育30 min,采用200μM的H_2O_2作用1 h后,进行50种药物成分的筛选,先后共发现34种有效中药药物成分具有抗氧化作用。我们从中选取抗氧化作用较为明显的红景天甙作为下一步的研究。 3.红景天甙的抗氧化保护作用及其机制探讨 (1)与正常对照组比较,200μM的H_2O_2作用1h后,细胞存活率明显降低;0.5μM,1μM的红景天甙在细胞氧化损伤后细胞存活率略有升高,10μM和100μM的红景天甙能明显提高细胞在氧化损伤后的存活率,而200μM和400μM的红景天甙对细胞的保护作用并不明显。 (2)采用倒置相差显微镜进行形态学观察,可以看到,氧化损伤组引起细胞发生水肿,部分细胞内部出现空洞等坏死性症状;1,10,100μM的红景天甙均可减轻低氧后引发的形态学改变,如细胞水肿减轻、结构相对完整等。 (3)台盼蓝染色计数结果显示,与正常对照组比较,损伤组PC12细胞死亡率明显升高,而1,10,100μM的红景天甙抑制了氧化损伤后细胞死亡率的升高,且有浓度依赖性。 (4)用BrdU掺入流式细胞方法测定细胞增殖情况,结果显示,经红景天甙处理后的PC12细胞,相对于未加药组出现不同程度的增殖,且其增殖与红景天甙药物浓度成正比,进一步证明红景天甙具有促细胞增殖作用。 (5)采用Western Blot方法观察细胞内APE/Ref-1的表达变化。结果显示,H_2O_2损伤使APE/Ref-1表达急剧降低。 【结论】 1.建立了抗氧化应激药物筛选的细胞模型,并运用其进行了大量药物筛选,从50种中药有效成分中先后筛选出具34种具有抗氧化作用的药物成分。红景天甙是其中含较量高且抗低氧化应激作用较为显著的药物成分之一。 2.红景天甙对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化损伤具有保护作用; 3.首次在细胞水平证实红景天甙的抗氧化应激的保护作用可能与其促进细胞增殖作用有关。 4.在PC12细胞氧化应激模型中,APE/Ref-1表达与抗氧化应激有关,红景天甙抗氧化损伤作用是否通过对APE表达的影响来实现仍需进一步实验证明。


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