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供者细胞脾内移植诱导小鼠气管移植耐受

王兴安  
【摘要】: 肺移植是治疗终末期肺病唯一有效的方法,但目前面临困境,免疫抑制效果尚显不足,免疫治疗相关并发症已十分严重,移植物排斥和免疫治疗相关疾病严重影响了肺移植受者的长期生存。继续加强非特异性免疫抑制可能对改善总体结果无益。 诱导移植耐受,即供者特异性免疫耐受,是目前最有希望的解困之道。在骨髓移植(BMT)和供者特异性输注(DST)这两个耐受现象的启发下,含BMT方案和含DST逐渐发展成为移植耐受研究领域的两类经典诱导方案。2008年一个令人振奋的肾移植临床试验报告称,在5例受者中有4例经含BMT方案成功诱导出移植耐受。然而,辐照副反应和/或移植物抗宿主反应(GVHR)风险仍是含BMT方案、含DST方案应用于临床器官移植的重大阻碍,尤其是对于那些终末期肺病患者。在过去十年,随着共刺激阻滞药物和新型免疫抑制剂的出现,非特异性免疫抑制被进一步加强,但诱导供者特异性耐受的研究进展不大。 模仿其他耐受现象可能是研究供者特异性耐受诱导的另外一个突破口。除了BMT、DST相关耐受外,另外还有两个已知的耐受现象,也就是自发肝移植耐受和多器官移植的免疫特惠现象。已经明确,在啮齿类动物模型中,肝、脾或胸腺的异体移植物可为同期或后续的同一供者来源的其他器官移植物提供免疫保护。由于操作复杂、创伤大,把联合多器官移植开发成为像含BMT方案或含DST方案那样的耐受诱导方案几乎是不可能的。 移植领域近期一个新进展是,肝细胞移植可取代实体肝移植治疗某些急性肝衰竭。在小鼠模型,肝细胞移植是通过脾内注射供者肝脏细胞来完成的。除了肝脏,脾脏和胸腺都可制成单个细胞悬液。因此,用细胞移植取代脾、胸腺实体器官移植也是有可能的。 本研究拟通过细胞移植来复制肝、脾和胸腺实体器官移植对小鼠异位气管移植物的免疫保护作用。 第一部分:脾内细胞移植取代脏器移植诱导小鼠气管移植物耐受的可行性研究 目的:研究脾内细胞移植取代脏器移植诱导小鼠气管移植物耐受的可行性 材料与方法:供者为6~8周龄健康雄性BALB/c(H-2~d)小鼠,受者为6~8周龄健康雌性C57BL/6(H-2~b)小鼠。所有受者术前1d接受。~(60)Coγ射线全身辐照(TBI:5.5Gy),手术当天接受气管异位移植和细胞移植。除了对照组(Con)外,200μl的5×10~6骨髓细胞经尾静脉注入。5.5B、5.5BS、5.5BT、5.5BH组受者分别接受脾内注射PBS(100μl)、脾细胞(1×10~7/100μl)、胸腺细胞(1×10~7/100μl)、或者肝脏细胞(1×10~7/100μl)。在术后1、3、5、7周流式细胞仪检测外周血单核细胞的混合嵌合。监测GVHR,直到受者死亡或者8周的观察期到期。所有死于GVHR的受者做尸检。组织学检查气管移植物、脾、肝和肺。 结果:在5.5BS、5.5BT组的受者检测到供者巨嵌合(>1%),第1周末时分别为54.3±13.1%和47.6±17.1%,但到7周末时很快降到9.9±7.0%和5.8±7.6%。这两组受者在7周之后出现严重的GVHR,死亡率高达50%和60%。5.5B、5.5BH、Con组未出现嵌合,没有GVHR,也没有死亡。7周时气管管腔在5.5B、5.5BH、Con组均已完全闭塞,而在5.5BS、5.5BT组闭塞25%。 结论:脾内细胞移植可以取代脾、胸腺的实体脏器移植,诱导小鼠异位气管移植模型的移植耐受。这种移植后初期形成的免疫稳态很脆弱,在没有免疫抑制保护下迅速瓦解。脾内肝细胞移植技术上可行,但不能发挥类似于实体肝移植物的免疫保护作用。 第二部分:脾内注射与其他细胞移植途径的比较研究 目的:确定脾内、胸腺内、静脉内细胞移植三种途径中哪一种最佳。 材料与方法:供者为6~8周龄健康雄性BALB/c(H-2~d)小鼠,受者为6~8周龄健康雌性C57BL/6(H-2~b)小鼠。所有受者术前1d接受~(60)Coγ射线全身辐照(TBI:5.5 Gy),手术当天接受气管异位移植和细胞移植。除了对照组(Con)外,200μl的5×10~6骨髓细胞经尾静脉注入。5.5BT和5.5BBs组受者分别接受脾内注射胸腺细胞(1×10~7/100μl)、未分类的骨髓细胞(1×10~7/100μl)。5.5BTt组受者接受胸腺内注射胸腺细胞(每叶一半,总计1×10~7/100μl)。5.5BB组受者接受额外剂量(1×10~7/100μl)的尾静脉内骨髓移植。在术后1、3、5、7周流式细胞仪检测外周血单核细胞的混合嵌合。监测GVHR,直到受者死亡或者8周的观察期到期。所有死于GVHR的受者做尸检。组织学检查气管移植物、脾、肝和肺。 结果:在5.5BT、5.5BTt和5.5BBs组的受者检测到供者巨嵌合(>1%),第1周末时分别为47.6±17.1%、40.1±8.3%和33.2±11.5%,但到7周末时很快降到5.8±7.6%、0.06±0.03和0.08±0.02%。5.5BT组受者在7周之后出现严重的GVHR,死亡率高达60%。5.5BB和Con组未出现嵌合,没有GVHR,也没有死亡。7周时气管管腔在5.5BTt和5.5BBs几乎闭锁、在5.5BB和Con组完全闭塞,而在5.5BT组闭塞仅25%。 结论:在免疫保护方面,供者细胞脾内移植优于胸腺内移植和外周静脉移植。移植细胞的免疫反应性越大、免疫调节作用越好,脾内细胞移植是利用供者免疫反应性细胞诱导耐受的最佳途径。 第三部分:脾内细胞移植的免疫特惠强度 目的:明确脾内细胞移植的免疫特惠强度。 材料与方法:供者为6~8周龄健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠,受者为6~8周龄健康雌性C57BL/6(H-2b)小鼠。所有受者术前1d接受~(60)Coγ射线全身辐照(TBI:3.0Gy),手术当天接受气管异位移植和细胞移植。除了对照组(Con)外,200μl的5×10~6骨髓细胞经尾静脉注入。3.0B、3.0BS、3.0BT、3.0BST、3.0BSTB和3.0BSTBL组受者分别接受脾内注射PBS(100μl)、脾细胞(1×10~7/100μl)、胸腺细胞(1×10~7/100μl)、脾+胸腺细胞(总计1×10~7/100μl)、脾+胸腺+骨髓细胞(总计1×10~7/100μl)、脾+胸腺+骨髓+外周血单核细胞(总计1×10~7/100μl)。在术后1、3、5、7周流式细胞仪检测外周血单核细胞的混合嵌合。监测GVHR,直到受者死亡或者8周的观察期到期。所有死于GVHR的受者做尸检。组织学检查气管移植物、脾、肝和肺。 结果:所有实验组的受者在第1、3、5、7周末时均未检测到外周血供者巨嵌合,没有GVHR,也没有死亡。7周时气管管腔在所有实验组均完全闭塞。 结论:当TBI从5.5Gy降到3.0 Gy,BMT(5×10~6/只)和脾内细胞移植(1×10~7/只)的方案不能诱导外周血嵌合与移植耐受。结合第一、二部分的研究推断,脾内细胞移植免疫特惠强度大致相当于3~5.5Gy TBI,可能不如实体脾、胸腺移植,但优于DST。


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