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球培养法富集肝癌干细胞样亚群及其特征鉴定

曹璐  
【摘要】: 研究背景和目的 近年来,随着干细胞概念被引入肿瘤学研究,肿瘤干细胞学说逐渐形成。该学说认为,导致肿瘤发生和维持肿瘤生长的是一小群叫做“肿瘤干细胞”的细胞;这些细胞在肿瘤组织中数量极少,具有自我更新、分化及抗药能力等干细胞样特性;此外还具有体内高致瘤性。肿瘤干细胞分离对于肿瘤学研究具有重要意义。在过去的数年中,研究者通过分离侧群细胞或应用荧光活化细胞分选法(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)或免疫磁性细胞分选法(Magnetic-activated cell sorting, MACS),以CD133、CD90、OV6、EpCAM等为标志物分离和鉴定到具有很强的体外克隆形成及体内成瘤能力的肝癌细胞亚群,为肝癌干细胞的存在提供了有力证据。但是目前不仅对肝癌干细胞特异性标志分子存在争议,而且缺乏肝癌干/祖细胞在体外培养扩增的证据。本研究旨在建立一种体外有效富集、扩增、鉴定具有肝癌干细胞特征的细胞亚群的方法,为进一步研究肝癌干细胞生物学特性和耐药机制等奠定必要的实验基础。 方法 应用干细胞培养体系和非附着性球培养法从肝癌细胞系PLC/PRF/5、Huh7、HepG2、MHCC97-H中富集到未分化状态的肝癌细胞球,并进行体外扩增。对PLC/PRF/5细胞球进行了一系列特征鉴定,包括: (1)球形成实验 (2)体外克隆形成实验 (3)药物敏感性实验 (4)干细胞分化实验 (5)干细胞基因差异表达实验 (6)动物体内成瘤实验 (7) RT-PCR芯片分析结果 (1)单个PLC/PRF/5细胞可形成非附着性三维立体球。 (2) PLC/PRF/5球细胞的体外集落形成能力是PLC/PRF/5细胞的2.2倍。 (3)与在3μg/ml、5μg/ml、9μg/ml cisplatin作用12 hr后,细胞球存活率分别是PLC/PRF/5细胞的1.4、1.9、1.8倍,cisplatin作用24 hr后分别是1.5、2.1、2.3倍。 (4) PLC/PRF/5球细胞在分化培养基中出现梭形拉伸的非肝细胞样细胞,其肝细胞标志蛋白ALB、Hep-Par1表达丢失或显著降低,而骨骼肌和心肌细胞特异性标志分子MEF2C表达增强。 (5)已报道的肝癌干细胞标志物CD133、EpCAM、OV6、CD44在PLC/PRF/5球细胞中表达明显上调。 (6)最少500个球细胞接种到NOD/SCID小鼠皮下即可成瘤,而PLC/PRF/5细胞则需20万个才可成瘤,是球细胞的400倍。 (7)CSL非依赖Notch信号通路的下游蛋白DTX1和Ep300在PLC/PRF/5球细胞中高表达。结论 球培养法能够从肝癌细胞系中有效富集到肝癌干细胞样亚群,并可长期培养、体外扩增。应用该方法可以建立合适的体外模型,从而方便地研究肝癌干细胞的生物学特性及耐药机制,有助于解决肿瘤干细胞在肝癌发生、发展乃至治疗中的诸多问题。


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