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苯并[α]芘上调肝细胞COX-2表达过程中NF-κB作用机制的研究

浦浩  
【摘要】: 研究背景: 肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一,且呈逐年上升之势,在我国,尤其是东南部,更是肝癌的高发地区。这一方面和遗传有关,另一方面,环境因素在肝癌的发生中也起了很重要的作用。苯并[α]芘(Benzo[α]Pyrene, B[α]P)是人类发现的第一种环境致癌物,广泛存在于煤、石油等燃烧产生的烟气以及香烟烟雾、汽车尾气中。作为大气致癌物的代表,以前人们对B[α]P致癌性的研究主要集中于B[α]P与肺癌发生的关系上面。然而有研究表明,在城市及大型工厂附近生长的谷物,水果和蔬菜中的B[α]P含量明显高于农村和偏远山区相应作物中的含量,用这一地区的谷物制成的植物油和用这一地区谷物喂养的食用动物的肉及奶制品中都有明显的高的B[α]P含量。鉴于肝脏是人体内最重要的B[α]P代谢器官,因此,对于B[α]P影响肝脏功能的具体机制有必要进行深入的探讨。环氧化酶(cyclooxygenase)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。哺乳动物中COX至少有两种同工酶,即COX-1和COX-2。COX-1在许多正常组织持续表达并维持正常生理功能,而COX-2在大多数组织中不表达或低表达,可被生长因子、内毒素及肿瘤促进因子诱导产生。有研究资料显示,B[α]P处理可以上调多种细胞中COX-2的表达。对COX-2的上调作用是B[α]P对细胞最常见的影响之一。此外,许多研究显示,COX-2在许多肝脏病变早中期中呈高表达,而抑制COX-2的表达,则可降低肝癌细胞的生长增殖能力。鉴于以上情况,有必要对B[α]P影响正常肝细胞而非肝癌细胞中COX-2表达的机制进行探讨。 研究内容及结果: 第一部分:苯并[α]芘处理对肝细胞中COX-2表达的影响 在这部分实验里,我们首先在人肝细胞Chang Liver中转入了含有COX-2启动子的荧光素酶质粒载体。稳定转染细胞株构建成功后,将B[α]P加入到细胞培养液中对细胞进行刺激。以一定剂量刺激一定时间之后,将细胞裂解观察其中荧光素酶的活性变化情况。本部分实验结果证实,Chang Liver细胞中COX-2表达的上调表现出对B[α]P处理剂量和时间的双重依赖性,从而明确B[α]P对Chang Liver细胞中COX-2的表达具有上调作用。之后,我们又通过Western Blot实验验证了我们的观察结果。 第二部分:苯并[α]芘诱导Chang Liver细胞COX-2上调过程中NF-κB的作用 在这部分实验中,我们在对Chang Liver细胞进行B[α]P处理之前,先在细胞的培养液中加入了NF-κB的抑制剂PDTC,待抑制剂生效后,再对细胞进行B[α]P加药处理刺激。之后,与前一部分一样检测COX-2荧光素酶活性的变化情况。实验结果证实B[α]P诱导的COX-2上调依赖于NF-κB的上调。在后续的实验中,我们使用Western Blot实验证明Chang Liver细胞中的NF-κB p65亚基确实会在B[α]P处理之下发生明显的核内转移,从而导致NF-κB活性的上调。 第三部分:苯并[α]芘通过PI-3K. ERKs通路诱导肝细胞中NF-κB表达的上调 在这部分实验里,我们先将含有NF-κB DNA结合序列的荧光素酶报告基因质粒转入了Chang Liver细胞中,待稳转细胞系建立之后,我们首先在细胞培养液中加入了MAPK和PI-3K信号转导通路的抑制剂,在此之后对细胞进行了B[α]P加药处理。以一定剂量处理一定时间之后,我们观察了细胞中NF-κB荧光素酶报告基因活性的变化情况。实验结果显示,B[α]P处理上调NF-κB活性的效果可被ERKs及PI-3K的特异性抑制剂所阻断。这提示B[α]P主要通过上述两条信号转导通路介导了胞内NF-κB的活性上调。 研究结论: 1.苯并[α]芘的刺激可以明显促进Chang Liver细胞内COX-2活性的上调。 2. Chang Liver细胞中COX-2报告基因在苯并[α]芘刺激下的活性上调主要依赖于NF-κB的活性上调。 3. Chang Liver细胞中NF-κB的活性上调主要依赖于PI-3K和ERKs途径。


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