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人肝源性干细胞在Fah~(-/-)Rag2~(-/-)小鼠中生物学行为的研究

刘芳遐  
【摘要】: 肝移植是目前终末期肝脏疾病唯一有效的治疗手段,但供肝来源的缺乏使其临床应用受到很大的限制。近二十年来,作为原位肝移植的替代方案,临床上一直致力于开展肝细胞移植技术的研究,并取得了一定的疗效。然而,可用于分离肝细胞的高质量供体肝脏在数量上无法得到保证,严重制约着肝细胞移植的临床应用。干细胞生物学的研究已经表明,干细胞具有呈指数分裂的增殖能力,也具有重新形成干细胞巢,并分化产生特定功能细胞,以重新建立组织的基本生物学特性。特别令人鼓舞的是,在体外实验中已有可能使胚胎干细胞和来源于胎肝组织的肝干细胞分化为肝前体细胞、成熟的肝细胞及胆管细胞,并且在活体动物的移植实验中也观察到了外源的干细胞对损伤肝脏的再殖(repopulation),能够使损伤肝脏在结构上和功能上得到有效的恢复。这些进展的取得,充分显示了利用干细胞对人类肝脏疾病进行临床治疗的可能性。 本实验室以4.5-6周的流产人胚胎作为分离肝干细胞的材料,通过克隆化培养建立了人胎肝来源的干细胞系(hFLSC)。hFLSC具有以下的特性:①具有强大的增殖能力;②表达多种类型的分子标记:不仅表达肝干细胞相关的分子标志(如AFP、ALB、CK8、CK18、CK19、GGT、DPPⅣ、c-Met、Thy-1和c-kit等),还表达间质细胞的部分分子标志(如CD44、CD29、SDF-1等),但不表达造血干细胞标志(如CD44、CD29、SDF-1等);③具有多潜能性:在体外诱导实验中,能分化为肝细胞、胆管细胞、脂肪细胞、成骨细胞;④可以参与小鼠受损肝脏的再生:在四氯化碳急性损伤的重度联合免疫缺陷小鼠体内,检测到标记有绿色荧光蛋白基因的hFLSC细胞。然而,由于四氯化碳诱导的急性肝损伤模型本身的缺陷,不能对hFLSC移植后在小鼠体内的植入、归巢、再殖及其功能进行充分的评价。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetate hydrolase, FAH)基因剔除小鼠模型是评价外源性干细胞再殖损伤肝脏的理想动物模型,FAH基因剔除小鼠在细胞移植、再殖肝脏研究方面得到了广泛的应用。该小鼠存在广泛而持续的肝损伤,所造成的肝脏微环境特别适合于移植细胞的增殖。本课题在已建立的hFLSC细胞系基础上,选择FAH基因剔除小鼠模型作为评价hFLSC再殖损伤肝脏的基本动物模型,进一步探索hFLSC在小鼠体内的生物学特性以及其作为肝细胞移植细胞来源的可能性,为人胎肝来源的肝原始细胞的基础研究及临床应用建立基础。 本课题分为两个部分:在第一部分实验中,通过对Fah-/-小鼠进行同品系野生型小鼠肝细胞的移植,观察Fah-/-小鼠肝再生环境促进移植肝细胞增殖的作用,为下一步进行hFLSC移植奠定基础。同时,虽然已知Fah-/-小鼠肝细胞自身的损伤是导致外源细胞植入和增殖的主要因素,然而对其病理学变化尤其采用电镜的方法分析肝细胞损伤的特点目前尚未见报道。本研究取Fah-/-小鼠停药后不同时间点的肝脏进行了HE染色和电镜检测,对Fah-/-小鼠肝脏损伤后的病理学变化进行了初步观察。在第二部分实验中,为了获得免疫缺陷的FAH基因剔除小鼠品系用于hFLSC移植,我们应用Fah-/-小鼠与Rag2-/-免疫缺陷小鼠进行杂交,建立了Fah-/-Rag2-/-小鼠品系。流式细胞仪检测表明Fah-/-Rag2-/-小鼠T细胞和B细胞功能缺失,可用于hFLSC的移植。将体外培养hFLSC细胞经脾脏注射移植Fah-/-Rag2-/-小鼠,取不同时间点的小鼠肝脏,通过免疫组织化学的方法检测hFLSC的植入、归巢及再殖效率,评价hFLSC肝向分化的能力。 第一部分的研究表明,撤除NTBC的Fah-/-小鼠表现为毛刺、弓背、体重明显下降,撤药6-7周后小鼠死亡;而正常喂养NTBC的Fah-/-小鼠全部健康存活,体重稳定增长,并且具有正常的繁殖能力。我们成功的实现了野生型小鼠肝细胞在撤药的Fah-/-小鼠肝脏中的再殖。FAH免疫组织化学染色表明,肝细胞移植1周后即可在Fah-/-小鼠肝脏内检测到表达FAH蛋白的野生型肝细胞。随着时间的延长,移植肝细胞的再殖程度逐渐增加,3周时肝脏再殖22±6%,4周时肝脏再殖38±11%,6周时肝脏再殖67±8%,8周时肝脏再殖78±17%。8周时移植的肝细胞几乎完全重建了Fah-/-小鼠的肝脏,再殖的肝细胞进入Fah-/-小鼠肝脏结构,但并不破坏肝脏的小叶结构,嵌合体肝脏的肝板结构和肝小叶结构仍然正常,且不形成病理性的结节增生。HE染色和电镜检测进一步证明Fah-/-小鼠自体肝细胞发生进行性、不可逆转的损伤是促进移植肝细胞增殖的内在机制。 第二部分的研究表明,首先,我们成功建立了Fah-/-Rag2-/-小鼠品系:以Fah-/-小鼠为参照,以CD3、CD19为标志物,流式细胞仪检测Fah-/-Rag2-/-小鼠骨髓细胞中T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)的数量变化,结果表明Fah-/-Rag2-/-小鼠T细胞和B细胞功能缺失。其次,hFLSC移植Fah-/-Rag2-/-小鼠后,在1、3、5、6、8周,应用Fah免疫组织化学染色都能检测到hFLSC存在,因为FAH酶的表达是检测再殖细胞(Fah+/+)的一个理想标志。我们进一步通过肝细胞功能蛋白——白蛋白免疫组织化学染色的方法,初步评价了hFLSC在Fah-/-Rag2-/-小鼠肝脏中的肝向分化能力。结果表明部分小鼠肝脏标本白蛋白染色为阳性。初步的实验结果提示:移植的hFLSC能够植入到Fah-/-Rag2-/-小鼠受损肝脏中,但其肝脏再殖的效率较低,小鼠的肝脏功能不能恢复正常。 本研究的实验结果表明:Fah-/-小鼠是研究肝细胞移植的理想模型,Fah-/-小鼠自体肝细胞发生进行性、不可逆转的损伤是促进移植肝细胞增殖的内在机制;来源于4.5-6周的流产人胚胎的肝原始细胞可能是肝细胞移植的候选细胞之一,但其肝脏再殖效率可能与其成熟程度有密切的关系,临床应用前进行肝向诱导分化可能是必要的程序。


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