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血小板因子4及其17-70肽段在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究

杨龙江  
【摘要】: 目的:研究血小板因子4及其17-70肽段在多发性骨髓瘤发病过程中的作用。 方法:将含有PF4全长cDNA及17-70cDNA基因的质粒扩增,获得PF4全长cDNA及17-70cDNA基因序列,连接入穿梭质粒并行基因测序。用慢病毒包装系统合成含有PF4全长cDNA及17-70cDNA和空载体的慢病毒。分别用含有PF4全长cDNA及17-70cDNA和空载体的慢病毒的转染3种多发性骨髓瘤细胞株,即U266细胞,RPMI-8226细胞和LP-1细胞。筛选出稳定表达外源基因的多发性骨髓瘤细胞株。检测筛选出稳定表达外源基因的多发性骨髓瘤细胞株的细胞及上清液。用密度梯度离心法分离健康成人外周单个核细胞。经含重组人血管内皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子和20%新生牛血清的M199培养基培养,在第8天收集贴壁细胞。经光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪检测获得细胞。将获得的各组多发性骨髓瘤细胞与人血管内皮祖细胞共同培养,在共同培养48小时后观察人内皮祖细胞的增殖,凋亡和迁移情况。分别用稳定表达转染基因蛋白的骨髓瘤细胞株建立多发性骨髓瘤联合免疫缺陷小鼠动物模型。定期检测小鼠血清中人轻链蛋白的含量及血管内皮细胞生长因子含量。并检测肿瘤的体积和肿瘤内血管密度以及小鼠的生存期。 结果:穿梭质粒载体经全长测序示:分别含有正确PF4全长cDNA及17-70cDNA序列。筛选后转染含有PF4全长cDNA的多发性骨髓瘤细胞含PF4蛋白阳性。3种多发性骨髓瘤细胞株内部转染不同基因组间VEGF含量有统计学差异。表明转染PF4全长cDNA及17-70cDNA片段2组的MM细胞均有抑制分泌VEGF作用,转染PF4的17-70cDNA片段组有更强的抑制作用(P0.01)。获得的成人外周血单核细胞刚接种时均匀平铺在培养皿底,加入细胞因子培养24小时后开始贴壁样生长,3天后可见成集落样生长,第4天可见细胞集落增大,贴壁较牢。第8天部分呈梭形改变。2周后细胞呈长梭形改变,排列呈线状。第8天收获细胞,发现95%以上细胞摄取1,1′-二(十八烷基)-3,3′,3′,3′-四甲基吲哚羰基花青高氯酸,乙酰化低密度脂蛋白,并结合FITC标记荆豆凝集素。经流式细胞仪检测获得细胞发现CD133抗原决定簇阳性率为0.835±0.053;人血管内皮细胞生长因子受体2(VEGF-R2)阳性率为0.862±0.082;CD34抗原决定簇阳性率0.862±0.062。稳定表达转染基因的多发性骨髓瘤细胞株与人内皮祖细胞共培养48小时后,人内皮祖细胞的凋亡情况各组间无显著差异(P0.05)。人内皮祖细胞的增殖和迁移情况各组间有显著差异,转染PF4全长cDNA及17-70cDNA片段2组均有抑制作用,转染PF4的17-70cDNA片段组有更强的抑制作用(P0.05)。转染PF4或17-70cDNA或空载体的3种多发性骨髓瘤细胞分别植入联合免疫缺陷小鼠后,成功建立动物模型。注射部位逐渐出现肿块,经病理证实为浆细胞肿瘤。3种多发性骨髓瘤动物模型的肿瘤体积和肿瘤组织新生血管密度在转染不同基因组间均有统计学差异(P0.05)。同转染空载体组相比较,转染PF4全长cDNA组小鼠血清中人轻链蛋白含量降低,转染PF4的17-70cDNA片段组降低更加明显(P0.05)。同转染空载体组相比较,转染血小板因子4组小鼠血清中人VEGF含量降低,转染17-70cDNA组降低更加明显(P0.05)。3种多发性骨髓瘤动物模型的小鼠生存期经统计分析,转染空载体组小鼠生存期最短,和其它组小鼠生存期差别有统计学差异(P0.05)。 结论:成功筛选出稳定表达PF4基因或其17-70cDNA片段的多发性骨髓瘤细胞株,经检测转染PF4全长cDNA或其17-70cDNA片段均有抑制多发性骨髓瘤细胞分泌VEGF的作用,转染PF4的17-70cDNA片段抑制作用更强。成功从健康成人外周血中分离培养出内皮祖细胞。稳定表达转染PF4全长cDNA或其17-70cDNA片段的多发性骨髓瘤在体外研究中对人血管内皮祖细胞的生长和迁移有抑制作用。转染转染PF4全长cDNA或其17-70cDNA片段的多发性骨髓瘤细胞株在小鼠体内降低多发性骨髓瘤肿瘤负荷,抑制多发性骨髓瘤生长并延长小鼠的生存期。总之,PF4及其17-70肽段在多发性骨髓瘤发病过程中能通过抑制血管新生作用,对多发性骨髓瘤起抑制作用。


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