收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

锌指蛋白Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCL_4肝损伤的敏感性及其机理研究

谢志芳  
【摘要】: 锌指蛋白Zbtb20是一种含有POZ/BTBC2H2锌指结构的转录因子,可能在多种器官和组织的发育和功能调节中具有非常广泛和重要的作用。Zbtb20在出生后的肝脏中开始上调表达,到出生后8周达到成年水平。为了深入研究Zbtb20的体内生物学作用,我们利用Cre/LoxP条件基因打靶技术,成功建立了Zbtb20的肝细胞特异性基因敲除小鼠模型。通过对该小鼠模型的体内以及体外实验研究表明,Zbtb20是调控肝脏甲胎蛋白基因转录的重要转录抑制因子。然而目前还不清楚Zbtb20对肝细胞的体内物质代谢和解毒功能有何影响。 为了揭示Zbt20基因缺失后的肝细胞的物质代谢和解毒能力,我们建立了四氯化碳(CCl4)所致的急性肝损伤和慢性肝纤维化模型,系统比较了该基因敲除小鼠与正常对照小鼠的急性肝损伤程度、损伤后组织修复能力和慢性肝纤维化程度,并在此基础上对肝脏参与CCl4代谢的关键酶一细胞色素P450 2E1 (Cyp2El)的蛋白、mRNA、hnRNA表达水平进行分析,最后对影响Cyp2E1基因表达的因素进行初步分析,取得以下结果: 一、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4急性肝损伤具有抵抗作用。 具体表现在以下三方面:(1)组织学分析表明:单次注射CCl4后,Zbtb2O基因敲除小鼠和正常对照小鼠肝损伤高峰期均出现在注射后24 h,然而无论是在损伤高峰期还是此后的48 h和72 h,Zbtb20基因敲除肝组织的坏死面积均明显低于正常对照组,而且能很快得到修复。(2)TUNEL分析表明CCl4注射后72 h,Zbtb20基因敲除肝组织中的凋亡细胞数显著低于正常对照组。(3)CCl4注射后24 h、48 h和72 h, Zbtb2O肝细胞特异性基因敲除小鼠的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平均显著低于正常对照小鼠。而注射橄榄油(溶剂组)后,Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠的肝组织结构、凋亡细胞数及血清ALT和AST水平与正常对照小鼠相比均无显著差异。以上结果表明Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4的急性肝毒作用具有低敏感性。 二、CCl4急性肝损伤后Zbtb20缺失肝细胞未出现增殖活性异常增高现象。 为了检测肝细胞的增殖能力,我们在给小鼠注射CCl4后不同时间点进行了BrdU掺入实验,结果显示:CCl4注射后24h, Zbtb20基因敲除和正常对照肝组织中出现少量散在分布的BrdU日性细胞,在数量上两者没有显著性差异,提示在损伤的同时修复机制已开始启动。CCl4注射后48 h,Zbtb20敲除和正常对照肝组织中肝细胞增殖出现高峰,并且前者的增殖细胞比后者少,可能与其损伤程度轻有关。为了进一步证实BrdU的分析结果,我们又对肝组织进行了细胞增殖标记蛋白Ki67和CNA的免疫组化标记,结果与BrdU标记结果一致。溶剂组的Zbtb20基因敲除肝组织仅有很少BrdU阳性细胞,与正常对照小鼠相比无显著性差异,表明大部分肝细胞处于静息期。以上检测结果排除了Zbtb20基因敲除肝细胞在注射CCl4后发生异常高增殖的可能性,提示该小鼠对CCl4的低敏感性可能是由于其他机制造成的。 三、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCl4慢性肝纤维化作用具有低敏感性。 小鼠连续6周注射CCl4(每周2次)后,取肝组织进行HE和胶原纤维染色分析。染色结果显示正常对照肝组织在肝中央静脉周围区可见到肝细胞坏死、大量炎性细胞浸润和结缔组织增生,部分肝小叶结构紊乱,Sirius Red染色显示广泛的桥接纤维间隔形成“蜂巢”样结构。与对照小鼠相比,Zbtb20譬因敲除肝组织炎症反应较轻,肝小叶结构基本完整,桥接纤维间隔较少,相对胶原纤维面积较小。说明Zbt20基因敲除肝脏对CCl4慢性肝纤维化作用同样具有抵抗性。 四、Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA和蛋白表达水平下调,而Cyp2E1 hnRNA水平没有改变。 CCl4的急慢性损伤实验结果表明Zbtb20基因敲除肝组织对CCl4的敏感性远远低于正常对照组,为了进一步揭示其分子机理,我们对影响CC]4体内活化的关键酶Cyp2E1的蛋白表达水平进行检测。Western Blot结果显示,Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1蛋白的相对表达量与正常对照相比下调了60%。接着我们又对Cyp2E1蛋白的表达进行免疫组化分析。结果显示在Zbtb20基因敲除肝组织中该蛋白的表达仍遵循肝小叶中心区强而门管区弱的区域性特征,但阳性标记区域比对照组明显缩小。荧光定量PCR检测结果表明Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA水平下调了50%,而其hnRNA的水平与对照组相比没有显著性差异。提示该基因的表达在转录后水平受抑。 五、Zbtb20基因敲除肝组织中HNF1αmRNA表达水平和β-catenin的活化水平没有改变。 为了进一步揭示Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA水平下调的分子机制,我们检测了目前已知的在该基因转录激活中起主要作用的转录因子HNF1α的mRNA水平,结果显示,其mRNA表达水平与正常对照没有显著差异。β-catenin被报道可以影响Cyp2E1 mRNA的转录,因此我们又检测了该蛋白的活化形式(activeβ-catenin)在Zbtb20基因敲除肝组织中的表达水平,发现与正常对照也没有显著差异。鉴于Zbtb20基因敲除肝组织中Cyp2E1 hnRNA表达水平没有改变,影响该分子转录的HNF1αmRNA和activeβ-catenin水平均与对照小组没有显著差异,因此我们推测造成Cyp2E1 mRNA下调的机制可能发生在转录后水平。 六、Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血清胰岛素水平没有改变,甲状腺素反应基因Spot 14 mRNA表达水平没有明显变化。 为了揭示Zbt20基因敲除肝组织中Cyp2E1 mRNA下调的转录后机制,我们检测了与其mRNA稳定性相关的血浆胰岛素和T3水平,并进一步检测了肝组织中的甲状腺素反应基因Spot14(S14)的表达水平。检测结果显示,Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠血浆胰岛素水平与正常对照小鼠没有统计学差异;血浆甲状腺素T3水平比对照组略高但肝组织中的甲状腺素反应基因Spot 14的表达水平与对照小鼠没有统计学差异。 总结以上实验结果,我们得出以下结论:Zbtb20肝细胞特异性基因敲除后引起Cyp2E1 mRNA和蛋白水平下调,从而导致该小鼠对CCl4诱导的急性肝毒作用和慢性肝纤维化作用产生抵抗性。导致该小鼠肝细胞中Cyp2El mRNA水平下调的机制可能发生在转录后水平。以上结果表明Zbtb20除了调控甲胎蛋白基因转录外,还可能参与调控肝细胞的物质代谢和解毒功能。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 顾长海!400038重庆,吴易东!400038重庆,于乐成!400038重庆;重型乙型肝炎肝组织Fas/Fas配体表达与肝细胞凋亡的研究[J];中华内科杂志;1999年12期
2 李绍强 ,梁力建 ,黄洁夫 ,李智;Fas介导肝细胞凋亡在肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤中的研究[J];中华实验外科杂志;2002年01期
3 杜娟;厉有名;;细胞凋亡与重症胰腺炎[J];中华急诊医学杂志;2006年11期
4 窦骏;病毒性肝炎CTL介导肝细胞凋亡的研究近况[J];临床肝胆病杂志;1997年03期
5 刘平,程向明,张留保,周其锦,张爱羚,郭丹;环孢霉素A诱导肝细胞凋亡的实验研究[J];解剖科学进展;1997年03期
6 周一鸣;病毒感染与Fas/Apo-1和TNF-α介导的肝细胞凋亡[J];实用肝脏病杂志;1998年02期
7 南月敏;乔梁;于君;吴文娟;姚希贤;;Fas及其配体诱导非酒精性脂肪性肝炎肝细胞凋亡[J];中华消化杂志;2006年12期
8 何小艳;唐红;黄飞骏;;乙型肝炎病毒X蛋白与宿主细胞浆内蛋白质相互作用的研究[J];肝脏;2009年01期
9 张定凤;;肝细胞凋亡和病毒性肝炎[J];传染病信息;1996年04期
10 程尉新,金丽娟;大鼠肠缺血再灌注早期肝细胞凋亡及其调控[J];中国病理生理杂志;1998年03期
11 于峻基;肝细胞凋亡研究近况[J];前卫医药杂志;1999年01期
12 傅德良;在鼠实验性重症急性胰腺炎中的肝细胞凋亡[J];国外医学.外科学分册;2000年04期
13 杨错;刘玉兰;张红梅;;肝细胞损伤机制及防治药物研究进展[J];实用药物与临床;2005年06期
14 秦波,张定凤,马英,范开;乙型肝炎患者肝组织Fas/FasL表达及其在肝细胞凋亡中的作用[J];中华肝脏病杂志;1997年02期
15 胡聪!050081,韩聚强,孙辉臣,郝晓东,李彬,丁卫东;TNFα/ActD诱导的大鼠肝细胞凋亡超微结构观察[J];肝脏;2001年02期
16 向晓星!200030,王国俊!200030,蔡雄!200030,李玉莉!200030;氧化苦参碱对小鼠急性肝损伤早期肝细胞凋亡的作用[J];肝脏;2001年S1期
17 路雪雅,张颖;d-儿茶精抗肝细胞凋亡的实验研究[J];中国生化药物杂志;2005年01期
18 ;全身照射诱发小鼠肝细胞凋亡的动态变化[J];国外医学.免疫学分册;1996年06期
19 印彤,童善庆,陆德源;超抗原SEB致小鼠肝细胞凋亡[J];中华微生物学和免疫学杂志;1997年05期
20 张志军;茵陈蒿汤及其成分抑制肝细胞凋亡的作用[J];国外医学.中医中药分册;1997年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 慕永平;刘平;王磊;都广礼;龙爱华;李风华;;CCl_4大鼠肝硬化形成过程中Caspase-12蛋白表达与肝细胞凋亡的相关性研究[A];第十五次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2006年
2 占秀安;王敏;李建新;许梓荣;;过量饲料氟诱导仔猪肝细胞凋亡的机理研究[A];全国动物生理生化第九次学术交流会论文摘要汇编[C];2006年
3 樊丽琳;陈东风;;Bcl-2、Bax在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
4 李敬东;覃扬;李波;刘建余;孙芝琳;孙泽芳;;P53和Bcl-2在大鼠门静脉缺血后肝细胞凋亡中表达的初步研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
5 周滔;刘成海;;CCI4和LPS诱导的急性肝损伤模型中肝细胞凋亡与坏死比较分析[A];第八届全国中西医结合实验医学研讨会论文汇编[C];2006年
6 闫秀川;陈倩;沈丽;陶艳艳;刘成海;;丹酚酸B盐对肝细胞凋亡的影响与部分作用机制[A];第二十次全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2008年
7 徐凯进;李兰娟;邢卉春;沈恬;盛吉芳;郑树森;;大鼠肝缺血再灌注损伤中肝细胞凋亡的研究[A];第十次浙江省中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2008年
8 沈秀华;程五凤;谢良民;孙建琴;李峰;马琳;;维生素E、硒对急性肝损伤期肝细胞凋亡影响的研究[A];中国营养学会第八届微量元素营养学术会议论文摘要汇编[C];2003年
9 徐建生;陈德昌;杨兴易;李修江;潘署明;;黄芹抑制心肺复苏后大鼠肝细胞凋亡的实验研究[A];中华医学会急诊分会第五届全国危重病学术交流会论文汇编[C];2004年
10 周舟;赵永善;赵文胜;;异丙酚对大鼠肝脏缺血再灌注后肝细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响[A];2009年浙江省麻醉学学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 谢志芳;锌指蛋白Zbtb20肝细胞特异性基因敲除小鼠对CCL_4肝损伤的敏感性及其机理研究[D];第二军医大学;2010年
2 肖芳;Cr(Ⅵ)诱导肝细胞线粒体呼吸链功能紊乱在细胞凋亡与早衰中的分子机制[D];中南大学;2012年
3 刘慧敏;钙池操纵钙离子通道在乙醇诱导肝细胞钙超载及相关肝细胞损伤中作用的研究[D];山东大学;2012年
4 陶丽丽;C/EBP-α基因诱导肝细胞和肝星状细胞凋亡差异的体内外研究及乙酰化调控探讨[D];复旦大学;2012年
5 陈永标;线粒体转录因子A对肝外胆汁淤积肝细胞mtDNA氧化损伤的保护作用及机制研究[D];第三军医大学;2012年
6 汪纪仓;镉致大鼠肝细胞毒性机理研究[D];扬州大学;2010年
7 萧梅芳;肝细胞分泌的HMGB1蛋白的分离、纯化、鉴定及对小鼠巨噬细胞的作用[D];中南大学;2012年
8 倪宏;乙型肝炎病毒感染与肝细胞凋亡的关系研究[D];第一军医大学;2001年
9 陈晓阳;慢性间断性缺氧对小鼠肝脏结构和功能的影响[D];福建医科大学;2011年
10 王玉梅;在暴发性肝衰竭中细胞凋亡调控基因及NO、TNF-α对肝细胞凋亡的作用[D];中国医科大学;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 方德宝;前列腺素E_1对梗阻性黄疸大鼠肝细胞凋亡及相关基因Bax/Bcl-2表达的影响[D];安徽医科大学;2011年
2 李为民;抗ICAM-1单克隆抗体在大鼠肝移植急性排斥反应中的应用及肝细胞凋亡[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
3 肖杰;高钼对雏鸡肝肾影响的机理研究[D];四川农业大学;2010年
4 林杰;线粒体途径在肝移植缺血后处理中的作用机制研究[D];昆明医学院;2011年
5 郎洁;板蓝根多糖对自体肝移植大鼠一氧化氮和内皮素-1的影响[D];扬州大学;2010年
6 刁青;IRE1介导的内质网应激在实验性暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其机制[D];河北医科大学;2010年
7 孔剑琼;实验性ARDS时肝细胞凋亡动态变化的研究[D];新疆医科大学;2003年
8 高建芝;Fas-L、Caspase-3、NF-κB与脓毒症过程中肝细胞凋亡关系的研究[D];新疆医科大学;2004年
9 林雅军;胆必清颗粒抑制小鼠肠缺血/再灌注损伤所致肝细胞凋亡的作用及机理研究[D];天津医科大学;2003年
10 寿晓斌;实验性酒精性肝病肝细胞凋亡及其相关分子表达的研究[D];浙江大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 胡德荣;肝细胞损伤研究获进展[N];中国医药报;2003年
2 胡德荣;肝细胞损伤研究获重大进展[N];健康报;2003年
3 陶春祥;中药治疗乙肝的研究[N];中国医药报;2002年
4 罗剑;骨骼发育重要调控分子被发现[N];上海科技报;2009年
5 常怡勇;苦参素治疗慢性肝炎机理及应用[N];中国医药报;2004年
6 ;开创中药基因治疗乙肝新途径[N];上海科技报;2000年
7 龙华医院肝科 林淑华;益尔健肝灵临床应用[N];上海中医药报;2000年
8 赵和云;白细胞介素-10的应用研究[N];中国医药报;2003年
9 冯琳;HDV感染研究获突破性进展[N];中国医药报;2002年
10 王振坤;熊去氧胆酸——治肝病立新功[N];大众卫生报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978