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钙粘蛋白:A549细胞、HUVEC细胞的烟曲霉重要受体

徐小勇  
【摘要】: 随着免疫抑制人群的不断增加,机会感染的发病率急剧上升。机会感染中真菌感染死亡率高、治疗昂贵而困难,预后极差。对于移植患者来说,曲霉感染在机会真菌感染中占主要地位。移植患者中侵袭性曲霉病病死率高达60%-80%左右,严重威胁患者生命。即使及时、合理的使用抗真菌药物,侵袭性曲霉病的治疗有效率仍仅50%-70%左右。目前曲霉病中最重要的致病原为烟曲霉,占发病率的90%左右。烟曲霉是一种在广泛分布于自然界的腐生菌。正常人每天吸入烟曲霉的孢子量很多但并不发病,因为肺部功能强大吞噬细胞有效的清除了这些致病原;但免疫抑制患者的吞噬细胞功能受损,而未被吞噬的曲霉孢子就可能侵袭肺泡上皮,最后进入肺组织造成感染,侵入组织的曲霉发育成菌丝,菌丝侵袭血管、穿透内皮细胞可造成曲霉特征性病变—组织梗死和全身播散。可以看出烟曲霉侵袭宿主细胞是致病的重要环节,特别是探讨烟曲霉与肺泡上皮细胞、血管内皮细胞的相互作用不仅可以研究曲霉的致病机理,抑或可为治疗寻找新的靶点。 烟曲霉粘附、侵袭细胞可能涉及相当多的分子,包括粘附分子、模式识别分子等。较早的体外实验用纤维蛋白素原(fibrinogen)预处理烟曲霉的孢子,其粘附于肺泡上皮细胞(A549)的能力下降30%-50%。孢子并可以直接粘附于层连蛋白(laminin)、胶原(collagen)、纤连蛋白(fibronectin)。但其后相关的研究甚少。病原体如何粘附、侵袭非吞噬宿主细胞在一些微生物上有一定的研究。白色假丝酵母菌侵袭非吞噬细胞中研究得比较透彻,宿主细胞膜蛋白中的cadherin(钙粘蛋白)在白色假丝酵母菌进入宿主细胞过程中其关键作用。Cadherin是一类依赖于钙离子的细胞间粘附分子,能和其他相关的粘附分子结合介导细胞粘附。白色假丝酵母菌表面的凝集素同源物als3存在特定的β折叠结构,并能与上皮细胞、内皮细胞表达cadherin结合后介导白色假丝酵母菌进入宿主细胞。类似的产单核细胞李斯特菌细胞膜上的internalin A其膜外特定的富亮氨酸重复序列(Leucine rich repeat domain, LRR)也形成特定的β折叠结构与上皮表面的cadherin膜外结构结合而介导病原侵入宿主细胞。人肺泡上皮细胞也有E-cadherin(epithelial-type cadherin E钙粘蛋白)、内皮细胞有N-cadherin(neuron-type cadherin N钙粘蛋白)的表达;而念珠菌与烟曲霉同属真菌界,其胞膜也可能存在同源的蛋白。因此我们设想cadherin可能在烟曲霉侵袭上皮细胞时也起重要作用。因此本实验拟研究肺泡上皮细胞表达的E-cadherin、内皮细胞的N-cadherin是否在烟曲霉侵袭过程中也起特定的作用。 第一部分E-cadherin为肺泡上皮细胞粘附、吞噬烟曲霉孢子的重要受体 目的探讨E-cadherin在烟曲霉孢子粘附、侵袭肺泡上皮细胞(A549)过程中的作用。方法(1)体外培养A549细胞,提取A549总蛋白。与烟曲霉孢子共孵育,通过离心去除未与孢子结合的蛋白。EDTA解离与孢子结合的蛋白,Western-blot检测是否有E-cadherin的存在;免疫荧光法检测孢子表面是否存在E-cadherin。(2)荧光染色法建立A549粘附、吞噬烟曲霉孢子的体外模型,通过抗体阻断法、SiRNA下调A549细胞膜蛋白E-cadherin,观察A549粘附、吞噬烟曲霉孢子的能力的变化。(3)观察A549细胞膜蛋白E-cadherin是否随烟曲霉孢子侵入上皮细胞而变化。结果(1)A549的膜蛋白E-cadherin可以与烟曲霉孢子结合;(2)100个A549细胞粘附吞噬的烟曲霉孢子数在1、2、4小时分别为204±12、212±12.5、209±7.5;加入0.2mM EDTA后1小时粘附吞噬的孢子数为141±5.5,再加入钙离子后A549粘附吞噬的孢子数为218±17;而加入同浓度的镁离子后A549粘附吞噬的孢子数为147±5.5。在培养液中预先加入的1:50、1:100、1:200的E-cadherin抗体,100个A549粘附吞噬的烟曲霉孢子数为161.7±8.5、163.7±8.5、163±12。E-cadherin的SiRNA处理的A549细胞粘附吞噬的孢子数为167.67±9.5,联合1:50抗体处理后粘附吞噬的孢子数为141.3±9.6。(3) Western-blot检测发现A549在粘附吞噬烟曲霉孢子0、1、2、4小时E-cadherin的表达无明显改变。24小时10-7M的地塞米松处理A549 24小时E-cadherin的表达无明显改变。结论E-cadherin在人肺泡上皮细胞(A549)粘附、吞噬烟曲霉孢子的过程中起重要作用。 第二部分N-cadherin为人脐静脉内皮细胞粘附、吞噬烟曲霉菌丝的重要受体 目的探讨N-cadherin在HUVEC粘附、吞噬烟曲霉菌丝过程中的作用。方法(1)体外培养]HUVEC细胞,提取总蛋白。与烟曲霉菌丝共孵育,通过离心去除未与孢子结合的蛋白。EDTA解离与菌丝结合的蛋白,Western-blot检测是否有N-cadherin的存在;免疫荧光法检测孢子表面是否存在N-cadherin。(2)荧光染色法建立HUVEC粘附、吞噬烟曲霉菌丝的体外模型,通过抗体阻断细胞膜蛋白N-cadherin,观察HUVEC粘附、吞噬烟曲霉的能力的变化。(3)观察HUVEC细胞膜蛋白N-cadherin是否随烟曲霉孢子侵入上皮细胞而变化。(4)免疫荧光观察N-cadherin的定位是否与烟曲霉相关。结果(1)HUVEC的膜蛋白可以与烟曲霉菌丝结合。(2)正常]HUVEC在1小时后粘附吞噬烟曲霉菌丝为235±9.2,加入0.2mM EDTA后1小时粘附吞噬的菌丝数为126.3±11.6,再加入钙离子后粘附吞噬的菌丝数为239±24;而加入同浓度的镁离子后A549粘附吞噬的孢子数为137±18.4。在培养液中预先加入的1:50、1:100、1:200的N-cadherin抗体,100个HUVEC粘附吞噬的烟曲霉数为133.3±23、148±13、171±16。(3)流式细胞仪、Western-blot检测发HUVEC在粘附吞噬烟曲霉1、2、4小时N-cadherin的表达无明显改变。(4)免疫荧光法提示N-cadherin可以随烟曲霉菌丝而进入细胞内。结论N-cadherin在HUVEC粘附、吞噬烟曲霉菌丝的过程中起重要作用。


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