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修饰未折叠蛋白反应诱导骨髓瘤细胞分化的实验研究

邹剑峰  
【摘要】: 多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种浆细胞恶性肿瘤,以骨髓中异常浆细胞恶性增殖、分泌单克隆免疫球蛋白、正常免疫球蛋白受到抑制以及溶骨病变为特征。发生率占血液系统肿瘤的10%,占所有肿瘤的1%,死亡率占所有肿瘤的2%。美国癌症学会统计表明,2009年美国MM的新发病例约为20,580,包括男性患者11,680例,女性患者8900例,死亡约10,580例,MM发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤,成为血液系统的第二位常见的恶性肿瘤。在我国也呈逐年升高的趋势。MM的治疗主要包括传统化疗,造血干细胞移植以及新药治疗。目前,新的靶向治疗药物已经成为治疗MM的重要手段,但就目前而言,骨髓瘤仍是不可治愈的疾病。维甲酸在诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病领域取得的巨大成功,鼓舞人们进行深入研究肿瘤的分化治疗策略。但在诱导骨髓瘤细胞分化方面其作用机制尚未完全阐明。因此,需要对其分子生物学机制进一步研究,以便为临床新药的开发与使用提供理论依据,进而制定新的联合用药方案,提高临床疗效。 内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞中负责分泌性蛋白折叠和组装的细胞器。当细胞在病原感染、化学损伤、遗传突变、营养剥夺,以及正常分化(如B细胞分化)等各种内外源因素刺激下,ER中未折叠或错误折叠的蛋白增多,出现ER应激(ER stress),应激信号能通过ER膜传递到细胞核中,继而引起一系列特定的靶基因转录上调和蛋白质翻译水平下调,以使细胞能继续存活,这种反应就是未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。MM细胞是浆细胞克隆增生性肿瘤,同正常浆细胞一样,骨髓瘤细胞具有高度发达和扩张的粗面ER,每秒钟能产生成千上万个免疫球蛋白分子,大量的免疫球蛋白在分泌之前必须经过ER的正确折叠和组装。如果这些蛋白不能被正确折叠,就会出现ER应激,诱导UPR的产生。浆细胞通过UPR减少免疫球蛋白分子的翻译,增加ER伴侣分子GRP78(glucose regulating protein 78)和GRP94(glucose regulating protein 94)以及折叠酶的表达,增强ER相关蛋白质降解途径(ER-associated degradation, ERAD)活性,提高细胞处理未折叠蛋白的能力,使之存活。 目前研究显示ER膜上有3种跨膜蛋白感应ER应激:PERK(PKR-like ER kinase)、ATF6(activating transcription factor-6)以及具有激酶和核酸内切酶活性的IRE1(inositol-requiring enzyme 1)。活化后的IRE1具有核酸内切酶活性,对XBP-1 mRNA进行剪接形成376aa的XBP-1剪接蛋白(XBP-1s);未经剪接的XBP-1 mRNA则形成261aa的蛋白(XBP-1u)。XBP-1是具有b-zip结构的转录因子,大量证据表明XBP-1对B细胞分化成熟为浆细胞,并分泌免疫球蛋白是至关重要的,为浆细胞分化所必需。XBP-1-/-的B淋巴细胞胞浆中可以表达免疫球蛋白,但不能大量的分泌免疫球蛋白,也不能完成B淋巴细胞的最终分化过程;在XBP-1-/-的B淋巴细胞中经基因转染后重新表达XBP-1 mRNA,可以有效地恢复免疫球蛋白的分泌。因此,XBP-1在UPR时表达上调,是UPR的关键靶基因,也对浆细胞的成熟、分化具有重要意义。 目前研究显示UPR在正常B细胞向浆细胞的分化过程中起重要的作用,没有UPR,浆细胞不能完成最终的分化和分泌免疫球蛋白。XBP-1在UPR活化时表达上调,并增加UPR靶基因伴侣分子GRP78和GRP94的表达,调节UPR。XBP-1也是UPR反应元件中与浆细胞分化相关的唯一转录因子。 当前研究国际上对诱导分化治疗MM研究甚少,尤其通过修饰未折叠蛋白反应诱导MM分化还是空白。因此,我们设想通过UPR的经典诱导剂二硫苏糖醇(DTT)或衣霉素(tunicamycin)诱导MM细胞发生UPR,观察对MM细胞分化的影响,研究XBP-1u、XBP-1s以及下游的伴侣分子GRP78、GRP94等的表达,然后采用RNAi等技术,影响XBP-1u、XBP-1s等的表达修饰UPR,最终达到明确诱导MM细胞分化的机制。本实验研究包括以下三个部分: 第一部分小剂量UPR诱导剂诱导骨髓瘤细胞分化的实验研究 目的探讨小剂量UPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化作用。 方法用小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理MM细胞株U266, RPMI-8226。Annix V检测细胞的凋亡率。经细胞涂片,瑞氏染色后,显微镜下观察细胞形态;流式检测检测细胞表面CD49e的表达率;用人λ轻链ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中轻链蛋白的浓度。 结果UPR诱导剂TM 0.4μmol/L, DTT 0.5mmol/L处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226 72小时后,Annix V检测细胞的凋亡率均低于5%。细胞形态学观察与对照组相比即可见到细胞胞核缩小,胞浆丰富,核浆比例下降,核仁减少或消失,核染色质变粗、变密。有些细胞具有典型的碱性胞浆,胞浆丰富,出现胞核偏心,核染色质粗糙,凝聚成块状,着色深,排列成车轮状,,呈现成熟浆细胞特有的形态改变,有别于细胞凋亡的早期形态学改变。 U266细胞CD49e的阳性率在对照组8.61±0.82%,TM处理72h后,U266细胞CD49e的阳性率为43.15±3.78%,有统计学差异(p0.01),DTT处理72h后CD49e的阳性率为38.08±2.9%,有统计学差异(p0.01)。RPMI-8226细胞CD49e的阳性率对照4.89±0.37%,TM处理72h后,CD49e的阳性率为25.54±2.67%,有统计学差异(p0.05);DTT处理72h后CD49e的阳性率为11.83±1.38%(p0.05)。 U266细胞的培养上清液中轻链蛋白的浓度,对照组456.25±19.07ng/ml, TM处理72h组,692.35±45.4ng/ml,有统计学差异(p0.01),DTT处理72h后,轻链蛋白的浓度为614.42±22.67ng/ml,有统计学差异(p0.05)。 RPMI-8226细胞的培养上清液中轻链蛋白的浓度,对照组292.24±23.59ng/ml,TM处理72h组,407.16±18.09,有统计学差异(p0.01),DTT处理72h后,轻链蛋白的浓度为478.35±15.37g/ml,有统计学差异(p0.05)。 在原代细胞经UPR诱导剂处理72小时后,也得到有类似的结果,细胞具有形态学分化的表现,CD49e细胞的阳性率增加,培养上清液中轻链蛋白的浓度增加。 结论小剂量UPR诱导剂可以诱导骨髓瘤细胞株和原代细胞进一步的分化。 第二部分UPR诱导剂诱导骨髓瘤细胞分化过程中相关基因表达情况的研究 目的研究小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)在诱导骨髓瘤细胞分化过程中,未折蛋白反应相关基因GRP78,GRP94的转录水平变化,与UPR和B细胞分化密切相关的XBP-1u, XBP-1s在转录和蛋白翻译水平的变化。 方法小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226,荧光Realtime PCR检测基因GRP78, GRP94, XBP-1u,, XBP-1s的转录水平变化,Western Blot检测XBP-1u, XBP-1s蛋白翻译水平的变化。 结果小剂量UPR诱导剂(TM, DTT)处理骨髓瘤细胞株U266,RPMI-8226后与对照组相比,荧光Realtime PCR检测基因GRP78, GRP94, XBP-1u,的转录水平是明显上调的,上调水平约1.5~3.12倍,而XBP-1s的转录水平是下降的。Western Blot检测XBP-1u的翻译水平是相对增加的,而XBP-1s的蛋白翻译水平下调。 结论在骨髓瘤细胞的诱导分化过程中发生了未折叠蛋白反应,XBP-1u的转录和翻译水平是相对增加的。 第三部分调控基因XBP-1u/XBP-1s表达对骨髓瘤细胞分化的影响 目的研究基因XBP-1u/XBP-1s表达水平的差异对骨髓瘤细胞分化的影响。 方法分别采用siRNA沉默XBP-1u的表达,构建过表达质粒转染骨髓瘤细胞过表达基因XBP-1u和XBP-1s后,通过形态学观察,流式检测细胞表面CD49e的表达率,和ELISA试剂盒检测培养上清中轻链蛋白的含量。 结果采用siRNA沉默XBP-1u的表达后,骨髓瘤细胞的进一步分化被阻断;过表达XBP-1u可以促进骨髓瘤细胞的分化,表现为形态学上分化成熟表现,CD49e的阳性率增加,细胞上清液中轻链含量是增加的;而过表达XBP-1s则不能促进骨髓瘤细胞的分化。 结论XBP-1的表达水平与骨髓瘤细胞的分化密切相关,其中XBP-1u的上调在其中起着重要作用。


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