嗅觉系统神经发生过程的机制研究

【摘要】： 成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后神经再生能力非常有限,但嗅觉系统是一个特例。在嗅觉系统中,嗅神经元(olfactory receptor neurons, ORNs)可以终生不断更新替换,是研究神经发生的一个理想模型。目前,关于嗅觉系统为什么会终生具有再生能力；ORNs为什么可以终生不断更新替换；在嗅觉系统的神经发生过程中,嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)如何从嗅上皮向嗅球内迁移的；嗅神经轴突是如何从嗅上皮长入嗅球的；OECs与ORNs之间是如何相互作用的；嗅神经轴突投射到嗅球后是如何进行分选定位的,等等诸多问题都还不清楚。深入研究嗅觉系统的神经发生过程将有助于人们深入了解嗅觉系统发育和嗅觉可塑性的机理,为探索成年哺乳动物CNS不可再生的原因、寻找中枢神经损伤新的治疗策略提供重要的理论依据。本研究应用多种实验手段,主要探讨嗅觉系统神经发生的机制问题,主要包括以下两个方面的内容： 1、嘌呤能信号分子(purinergic signaling)抑制嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)迁移 成年哺乳动物中枢神经系统损伤以后再生极为困难,功能恢复极为有限。在中枢神经系统中,嗅神经是一类比较特殊的神经,嗅受体神经元终生可以不断再生。一般认为,成年后嗅神经之所以能够终生再生可能与该系统内嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells, OECs)这一类特殊胶质细胞的存在有密切关系。OECs是嗅觉系统特有的神经胶质细胞,它同时具有雪旺细胞(提供轴突再生微环境及髓鞘化作用)和星形胶质细胞(与中枢神经系统有较好的相容性)的特性,是目前已知唯一能同时存在于中枢(嗅球)和外周(嗅上皮)神经系统的胶质细胞。OECs作为嗅神经的成鞘细胞,在神经发生过程中,它起源于嗅上皮,包裹嗅神经轴突束并沿着该轴突迁移,支持和引导它们从外周穿越筛骨板长入位于中枢的嗅球。嗅鞘细胞具有促进嗅神经轴突生长、导向以及再生的能力。研究表明,嗅鞘细胞的迁移对嗅觉系统发育具有关键性意义。在嗅觉系统发育过程中,嗅神经元的迁移,轴突的生长、再生与靶向等一系列活动,都与嗅鞘细胞的定向迁移及迁移距离密切相关。然而,目前国际上对嗅鞘细胞迁移的具体调控机制了解还十分有限。 嘌呤能信号分子作为一种信号分子,在细胞的信号传递中起重要作用。目前,ATP的生理或病理来源问题已经被清楚的阐明了。据报道,嗅觉系统中的ATP是以囊泡的方式由ORNs释放。嘌呤能信号分子参与了胶质细胞的增殖和迁移过程。已有研究表明,嘌呤能信号分子可以作为“宿主组织损伤信号”(host tissue damage signaling)影响细胞的迁移。也曾有报道称,在嗅神经元损伤时嗅上皮(olfactory epithelium, OE)中嘌呤能信号可诱导介导的热激蛋白的表达,起神经保护作用。但是嘌呤能信号是否在成体OE的神经发生过程中对嗅鞘细胞的迁移起作用,目前仍未见报道。 本研究探讨了在嗅觉系统神经发生过程中嘌呤能信号分子的释放对OECs迁移的影响。首先,我们应用细胞划痕迁移实验和Boyden chamber细胞迁移实验,证明嘌呤能信号分子可以抑制体外培养的OECs的迁移。进一步采用免疫荧光染色和RT-PCR的方法,发现体外培养的OECs上表达嘌呤能受体P2Y1和P2Y2,而不表达其他亚型的嘌呤能受体。采用嘌呤能受体的拮抗剂阻断嘌呤能信号分子与其受体的结合,可以明显地减轻嘌呤能信号分子对OECs迁移的抑制作用。这提示嘌呤能信号分子抑制OECs迁移的作用应该是由P2Y1和P2Y2受体介导的。这些结果表明,嘌呤能信号分子可以作用于嗅鞘细胞上的P2Y1和P2Y2受体,从而抑制嗅鞘细胞迁移。通过本课题的研究,我们发现了调控嗅鞘细胞迁移的一个新的机制,这有助于加深人们对嗅鞘细胞和嗅受体神经元相互作用机理的认识,为深入了解神经发育和再生的机理提供了重要的理论依据,为寻找中枢神经疾病和损伤的有效治疗策略和治疗靶标提供了新的突破口。 2、HDACs在嗅上皮神经发生过程中的作用及其机制研究 嗅上皮的神经发生过程及其调控机制,是嗅觉发育生物学的重要问题。嗅受体神经元是嗅觉系统的一级神经元,也是唯一存在于嗅上皮的神经元。它接受外界气味分子刺激,并将信号向上传递至嗅觉中枢。ORNs是脊椎动物中唯一与外周环境直接接触的神经元,这一特点使得ORNs极易受到损伤。因此,ORNs的发生对于维持动物正常的嗅觉功能是非常重要的。哺乳动物的ORNs终生都处在不断地再生过程中。嗅上皮神经发生是一个极其复杂的过程,ORNs发育的每个阶段都受到相应的调控,但是迄今为止并不清楚这一重要过程的调控机制。 染色体核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化对组蛋白调控作用极其重要,可以影响增殖、分化及基因沉默等很多生物学过程。调控组蛋白乙酰化修饰过程的组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs),在神经发生过程中发挥着重要作用,参与神经干细胞的增殖、命运决定、分化等多个过程。2005年,MacDonald等人的研究显示,在嗅上皮干细胞和嗅受体神经元中有HDACs的表达。这提示,HDACs有可能参与了嗅觉发生的过程,但是目前尚无这方面的报道。 在本研究中,我们发现HDACs参与了嗅觉系统的神经发生过程。首先,我们通过体内实验发现,HDACs的抑制剂可以降低嗅上皮厚度和细胞总数。为了探讨HDACs与嗅上皮细胞增殖的关系,我们采用了BrdU染色,结果显示,在体外和体内,经HDACs抑制剂处理后,嗅上皮的细胞增殖受到了抑制。为了探讨HDACs与嗅上皮神经元成熟的关系,我们采用在体实验和蛋白印记的方法,发现HDACs抑制剂可以使小鼠嗅上皮中OMP阳性的嗅神经元数目减少且OMP的表达减少,并且HDACs这种影响嗅上皮细胞的增殖的作用是通过Notch2信号通路起作用的。上述结果强烈提示,HDACs具有通过Notch2信号通路调控嗅上皮的细胞增殖和嗅神经元的成熟的作用,HDACs活性被抑制将导致嗅上皮细胞增殖的减弱、嗅神经元的成熟被抑制,从而影响嗅上皮的正常形态,导致其厚度降低、细胞总数减少。本研究不仅为嗅觉系统的正常构建和维持提供了新的分子机制,而且为深入了解神经发育和再生的机理提供重要的理论依据。 本研究的主要发现总结如下： 1.在成体嗅神经发生过程中,嘌呤能信号分子通过作用于嗅鞘细胞上的P2Yl和P2Y2受体,抑制嗅鞘细胞迁移。 2. HDACs通过Notch2信号通路影响嗅上皮的细胞增殖及ORNs的成熟,参与了嗅上皮神经发生的过程。