骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用

【摘要】： 急性胰腺炎是常见急腹症之一,其中约10-20%的患者可发展为重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)。SAP发病凶险,预后差,临床死亡率高。目前,临床上对SAP的治疗仍以抑制胰酶分泌和合成,预防性应用抗生素和营养支持等保守治疗为主,缺乏特异有效的治疗方法。据报道,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)参与了急性胰腺炎的发病过程,动员MSCs可减轻SAP病情,改善其预后。本课题以SAP大鼠模型为研究对象,给予SAP雌性模型大鼠输注同种属雄性来源的MSCs,观察移植后SAP大鼠胰腺的病理损伤修复情况,明确同种异体来源的MSCs能否在SAP病理状态下迁移至损伤的胰腺组织,及不同微环境对MSCs迁移、分化的影响,初步探讨MSCs对SAP大鼠胰腺损伤修复的机制。 一、骨髓间充质干细胞的原代和传代培养 目的：建立骨髓间充质干细胞原代及传代的培养方法,通过培养传代,扩增出足量的骨髓间充质干细胞,为以后的实验做准备。 方法：在无菌条件下剪去大鼠双下肢,分离股骨,于超净台上剪开骨端,用10%胎牛反复冲洗髓腔直至骨干发白,1000rpm离心5分钟,弃上清,按5x105／cm2密度接种于含10%胎牛的DMEM+F12培养基中培养。24h内观察细胞的贴壁情况,此后,每12h观察细胞贴壁情况,待细胞生长至培养瓶面积80%时传代。首次传代后继续定期观察、传代。传至第三代(P3)时,胰酶消化,收获细胞并计数。进行流式检测及细胞活力测定。 结果：约24h后MSCs开始贴壁,贴壁后MSCs呈纺锤形及三角形等形态,并趋向集落样生长。经传代培养后,细胞成份逐渐得到纯化,至P3代时细胞形态单一MSCs占90%以上。流式细胞检测结果显示,代表MSCs的CD29+CD44+CD45-细胞群,经过传代培养,其所占比例逐渐增大,细胞群的组成逐渐趋于单一,至P3代时,CD29+CD44+CD45"细胞群达到95%以上。培养至P3代时细胞活力最好,约为96%,P4代后活力逐渐下降。 结论：本部分实验建立了稳定的MSCs原代和传代培养方法。获得的MSCs经贴壁传代培养,纯度达95%以上,流式鉴定结果显示为CD29+CD44+CD45细胞群。这为下部分实验提供了充足的MSCs产品。 二、重症急性胰腺炎大鼠模型的建立 目的：制作SAP动物模型,为研究胰腺损伤修复提供简便、可靠、重复性及可比性均较好的模型,了解大鼠SAP模型的病程规律,并为下一步实验提供关键的时间点。 方法：雌性SD大鼠46只,体重250-300g,随机分为2组：正常对照组(CON组,n=6)；SAP造模组(SAP组,n=30)。SAP组分为4h、12h、24h、48h、72h 5个时间点,每个时间点有6只大鼠。CON组大鼠3只不做任何操作处理,3只腹腔注射生理盐水2次。另取大鼠10只,均SAP造模,观察72h死亡率。造模前12h起禁食,自由饮水,将L-精氨酸溶于9g/L生理盐水中配制成浓度为20g/L的L-精氨酸溶液,调整pH值至7.0左右,2次腹腔注射(2.5g/kg体质量),中间间隔1h。在造模后4h、12h、24h、48h、72h处死动物,检测血清淀粉酶,获取胰腺、肺等组织,固定、石蜡包、切片、HE染色,依据schmidt及Mayer评分法进行评分。并观察三组动物72h的存活情况。 结果：造模后血清淀粉酶水平4h(4684±1844.4U/L)、12h (6940±1451.5U/L)、24h(9981±2901.6U/L)、48h (3431±1368.5U/L)、72h(1498±1865.9U/L)均显著高于正常对照组(P0.05)。其中造模后24h组血清淀粉酶水平显著高于其他各组(P0.05)。连续观察72h以上,正常组大鼠死亡率为0,SAP组大鼠死亡率为40%。显微镜下观察正常对照组胰腺组织结构清晰,腺泡小叶完整,间质无渗出。SAP组造模后4h即可见胰腺间质水肿,大量炎细胞浸润。12h胰腺腺泡细胞坏死。24h可观察到胰腺组织大片坏死,出血及明显炎细胞浸润。48h坏死加重,腺泡小叶结构严重破坏,可见皂化斑。72h胰腺组织坏死到达最高程度。胰腺病理评分显示,造模后4h起,胰腺病理评分即显著升高,至造模后72h胰腺病理评分达到高峰。 结论：本部分实验成功复制出L-精氨酸诱导的大鼠SAP模型,该模型制作方法简单,价廉,不需特殊材料及设备,可重复性好,损伤小,病变程度在不同的胰腺部位比较均匀一致,克服了其他模型需行剖腹术等缺点,大大减少了外源性细菌污染的机会,且与人类SAP的病程及组织学改变相似。是研究急性胰腺炎发病机制及防治措施较为理想、值得推广的动物模型。并且发现,SAP 24h时模型动物的胰腺病理损害最为严重,死亡率达高峰,因此,在后部分的实验中,我们选择24h为SAP模型的主要观测时间点和干预治疗时间点。 三、同种异体骨髓间充质干细胞移植对实验性重症急性胰腺炎的病情减轻作用 目的：明确同种异体来源的骨髓MSCs能否减轻SAP大鼠病情,能否对大鼠损伤胰腺发挥保护或修复作用。 方法：将SD大鼠随机分为2组：SAP+MSCs移植组(n=20):SAP大鼠接受同种异体MSCs移植治疗；SAP+培养基输注组(n=20):SAP大鼠接受等体积培养液。MSCs传代培养方法同第一部分。SAP动物模型制作方法同第二部分。MSCs移植组于SAP造模后24h输注P3代以上MSCs,约5-7×107/只。培养基输注组则于SAP造模后24h输注等体积培养液,2组大鼠均于输注后24h处死其中10只大鼠,抽取心尖血,测血清淀粉酶值,获取胰腺组织,一部分用于抽提RNA行RT-PCR检测TNF-a、IL-1βmRNA表达情况,另一部分组织用于HE染色,并行胰腺病理评分。剩余10只大鼠用于观察72h存活情况。 结果：SAP+MSCs移植组大鼠的胰腺病理评分显著低于SAP+MSCs移植组(P0.05)。两组大鼠的血清淀粉酶水平差异比较无统计学意义,但各时间点SAP+MSCs移植组血清淀粉酶水平相对较低。MSCs移植输注组胰腺组织TNF-a,IL-1βmRNA表达显著低于SAP+培养基输注组(P0.05)。MSCs移植组大鼠的72h生存率显著高于培养基输注组。 结论：MSCs移植治疗可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a,IL-1βmRNA的表达水平,减轻SAP大鼠胰腺病理损伤,改善SAP病情,提高SAP大鼠的存活率。 四、同种异体骨髓间充质干细胞向重症急性胰腺炎大鼠胰腺的迁移和分化 目的：观察同种异体MSCs在正常大鼠与SAP大鼠胰腺组织中的迁移、分化情况,了解不同微环境对MSCs迁移、分化的影响,初步探讨MSCs对SAP大鼠胰腺损伤修复的机制。 方法：将雌性SD大鼠随机分为3组：正常+MSCs移植组(n=10)：正常大鼠接受同种异体MSCs移植输注；SAP+MSCs移植组(n=10)：SAP大鼠接受同种异体MSCs移植治疗；SAP+培养基输注组(n=10):SAP大鼠输注等体积培养液。MSCs取自雄性SD大鼠,其传代培养方法同第一部分,传至第三代后,经DAPI标记染色。SAP动物模型制作方法同第二部分,为雌性SD大鼠。MSCs及培养基移植输注方法同第三部分。三组大鼠均于移植输注后72h处死大鼠,获取胰腺组织标本,病理评分胰腺炎症损伤程度,采用原位杂交(Chromogenic in situ Hybridization, CISH)的方法追踪MSCs迁移、运动的轨迹,并将原位杂交与CK19及a-淀粉酶免疫组化染色共定位。 结果：移植入的MSCs可以迁移至受体大鼠各脏器。且无论是正常胰腺还是SAP受损胰腺,MSCs均能迁移至胰腺组织中,但不同的微环境对MSCs的招募能力不同,正常+MSCs移植组中迁移入的MSCs呈散在分布于腺泡细胞、胰岛、胰管及血管上皮细胞中,SAP+MSCs移植组中迁移入的MSCs多集中分布在某些腺泡细胞、胰岛细胞或胰管上皮细胞中,我们还发现无Y染色体阳性显色的胰腺组织损伤较严重,腺泡结构破坏明显,有较多坏死组织及炎细胞浸润,而Y染色体阳性显色部位,腺泡结构较为完整。并经免疫组化染色证实迁移入的MSCs能分化为表达CK19的胰腺干细胞、胰管上皮或胰岛细胞及表达a-淀粉酶的胰腺腺泡细胞。 结论：炎性损伤的胰腺组织具有招募MSCs的能力,MSCs能定向迁徙和分化为部分胰腺组织细胞,并能减轻大鼠胰腺局部的炎症反应。 全文小结 本课题采用L-精氨酸2次腹腔注射法成功诱导SAP大鼠模型,通过对SAP病情指标的评估,确定24h为MSCs移植时间点。采用贴壁法,对MSCs进行原代和传代培养,进而应用同种异体MSCs移植治疗SAP,发现MSCs移植,可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a,IL-1βmRNA的表达水平,减轻SAP大鼠胰腺病理损伤,改善SAP病情,提高SAP大鼠的存活率。炎性损伤的胰腺组织具有招募MSCs的能力,MSCs能定向迁徙、定居和分化为部分胰腺组织细胞。