三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞组蛋白去乙酰化酶作用的实验研究

【摘要】： 多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)为浆细胞恶性肿瘤,以骨髓中异常浆细胞恶性增殖、分泌单克隆免疫球蛋白、正常免疫球蛋白受到抑制以及溶骨病变为特征。发生率占血液系统肿瘤的10%,占所有肿瘤的1%,死亡率占所有肿瘤的2%。美国癌症学会统计表明,2009年美国MM的新发病例约为20,580,包括男性患者11,680例,女性患者8900例,死亡约10,580例。而2008年,2007年,2005年美国新发的MM分别约为19,920例,19,900例,15,980例,而死亡病例分别约为10,690例,10,790例,11,300例。在我国也呈逐年升高的趋势。根据资料统计,MM发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤,成为血液系统的第二位常见的恶性肿瘤。MM的治疗主要包括传统化疗,造血干细胞移植以及新药治疗。目前,新的靶向治疗药物已经成为治疗MM的重要手段,但是这些新药确切作用机制尚未完全阐明。因此,需要对其分子生物学机制进一步研究。深入了解其作用机制,以便为临床用药提供理论依据,制定新的联合用药方案,提高临床疗效。 三氧化二砷(亚砷酸,arsenic trioxide, AS2O3)作为药物用于治疗疾病已有几千年,应用于治疗肿瘤也有100多年的历史,中医传统方剂青黄散、十味丸等对白血病有一定的疗效,鉴定其有效成分为含砷化合物。20世纪90年代,发现As203对急性早幼粒细胞白血病有极好的疗效,且没有严重的骨髓抑制毒性,使急性早幼粒细胞白血病的治疗得到了极大的突破。近年来,随着研究的深入,发现As203也有抗MM作用,用于复发难治患者的治疗。 As203的作用机制是多方面的,包括：1、抑制MM细胞增殖及诱导凋亡：白介素-6 (interleukin-6, IL-6)是调节MM的核心因子,能刺激MM细胞增殖,而且还能抑制地塞米松诱导的凋亡。而As203不但能克服IL-6的影响,并且能通过抑制MM细胞和骨髓基质细胞的黏附而抑制IL-6的产生。As203抑制MM细胞的增殖也与p21、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子有关。2、诱导活性氧族(reactive oxygen species, ROS)生成：细胞的存活和生长需要ATP提供能量,而ATP的合成需要消耗大量的氧,从而产生ROS,如H2O2。如果产生的ROS没有被抗氧化系统清除,就会对细胞造成损伤；ROS可以加强As203介导的细胞毒性作用。3、免疫增强作用：As203可以增强细胞的免疫功能而起抗MM的作用。4.抗血管生成作用：有学者研究发现As203抑制MM细胞在骨髓微环境的生长,发现As203能减少MM细胞与骨髓基质细胞的黏附,抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的产生。 但是,目前A8203抗骨髓瘤的确切作用机制仍然不清楚。三价的砷,包括亚砷酸钠及可溶性更高的As203可以通过与带有含硫基团的蛋白作用从而抑制体内很多种酶的活性。三价砷可以与一些重要蛋白上的密集的半胱氨酸残基作用,进而发挥其生物学效应。因此,富含半胱氨酸或是含有易接近的巯基的蛋白就有可能成为三价砷作用的靶点。 真核细胞转录受DNA折叠方式的影响。静止期细胞,DNA紧密折叠以防止转录因子进入。染色质是DNA的载体,目前广泛认为局部的染色质结构是调节基因表达的一个重要因素。染色质的结构受组蛋白翻译后修饰的影响。翻译后修饰有甲基化、磷酸化、乙酰化等。组蛋白乙酰化的水平受组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)的调节。组蛋白乙酰化水平的增加(高度乙酰化)伴随着转录活性的增加,乙酰化水平下降(低乙酰化)则基因表达受抑。HDAC作为调控基因的关键蛋白酶,其功能异常被证实与肿瘤的发生和发展有关。 既往研究表明,多个HDAC带有含半胱氨酸的区域,HDAC6在其C端有一段富含半胱氨酸和组氨酸的区域。HDAC2氨基酸序列的262和274位点为半胱氨酸,进一步研究表明半胱氨酸的S-亚硝基化可导致HDAC2活性下降。鉴于As203对富含半胱氨酸或是含有易接近巯基的蛋白的作用,HDAC具有与As203结合的结构基础。我们的实验将研究As203对HDAC的作用,是否抑制HDAC的活性,通过对HDAC的作用,进而影响到HDAC的底物,以及和这些底物蛋白相互作用的蛋白,从而改变下游的效应。这些目前国内外都还没有相关的研究报道。对As203在MM治疗中作用的深入研究,对于MM的临床治疗具有十分重要的理论和实践意义。 因此,我们检测了As203对HDAC是否有抑制作用；以骨髓瘤细胞系NCI-H929为研究对象,不同浓度和不同时间As203处理骨髓瘤细胞株和MM患者原代细胞后,观察HDAC在胞浆的底物α-微管蛋白乙酰化水平的变化；同时观察As203处理骨髓瘤细胞株后HDAC在胞浆另一底物热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)乙酰化水平的变化,探讨对其分子伴侣功能的影响,对其客户蛋白IκB激酶α(IκB kinaseα,IKKα)蛋白水平的影响。实验研究包括以下三个方面： 第一部分三氧化二砷对组蛋白去乙酰化酶的作用研究 目的探讨三氧化二砷(As2O3)对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的作用。 方法As2O3处理MM细胞株NCI-H929,提取细胞总蛋白,Bradford法蛋白定量,各处理组取相同量的蛋白通过比色法检测胞内HDAC的活性。采用HDAC抑制剂药物检测试剂盒检测As2O3对HDAC标准品活性的作用。 结果不同药物浓度的As2O3处理骨髓瘤细胞株NCI-H929后,测定胞内HDAC酶的活性。0.1μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性为对照组的83.5%,与对照组无明显差异(P0.05),而0.5μmol/L,1μmol/L,2μmol/L,4μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的76.8%,72.3%,69.1%和62.8%(P0.05)。用2μmol/L的As2O3不同时间点分别处理细胞后,测定胞内HDAC酶的活性。As2O3处理24h组和48h组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的74.7%和66.3%(P0.05)。As2O3处理HDAC标准品,0.5μmol/L, 1μmol/L, 2μmol/LAs2O3处理组HDAC酶的活性为对照组的95.96%,95.71%,95.67%,与对照组无明显差异(P0.05),而4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L,32μmol/L,64μmol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的91.08%,81.21%,65.54%,52.45%和25.89%(P0.05)。 结论As2O3对HDAC的活性有明显的抑制作用,随着As2O3浓度增加和处理时间的延长抑制作用增强。 第二部分三氧化二砷对α-微管蛋白乙酰化水平的作用研究 目的研究As2O3对HDAC6胞浆底物之一α-微管蛋白乙酰化水平的影响。 方法As2O3处理MM细胞株NCI-H929, MM患者原代细胞以及NCI-H929硼替佐米耐药细胞株,采用Western Blot法检测HDAC6在胞浆的底物之一α-微管蛋白的乙酰化水平的变化。 结果不同药物浓度As2O3处理MM细胞株NCI-H929 (1μmol/L,2.5μmol/L, 5μmol/L,7.5μmol/L, 10μmol/L) 48h,α-微管蛋白的乙酰化水平较对照组呈剂量依赖性升高,1μmol/L浓度即升高明显,具有统计学意义(p0.05)。2.5μmol/LAs2O3不同时间处理细胞后,α-微管蛋白的乙酰化水平呈时间依赖性升高,24h后即升高明显,具有统计学意义(p0.05)。As2O3处理NCI-H929硼替佐米耐药细胞株后,α-微管蛋白的乙酰化水平也是呈浓度和时间依赖性升高。将5μmol/L的As2O3处理MM患者原代细胞12h后,α-微管蛋白的乙酰化水平增加。 结论As2O3可以增加α-微管蛋白的乙酰化水平,随着处理浓度的增加和处理时间的延长,乙酰化水平增加。 第三部分三氧化二砷对伴侣分子热休克蛋白90的作用研究 目的研究As2O3对HSP90乙酰化水平的作用,并探讨As2O3对HSP90伴侣分子功能的影响,以及对其客户蛋白表达水平的影响。 方法不同浓度As2O3处理MM细胞株NCI-H929,通过免疫共沉淀检测HSP90乙酰化水平的变化以及HSP90与其客户蛋白KKa的结合能力,采用Western Blot法检测KKa在细胞内表达水平的变化。 结果不同浓度药物(2.5μmol/L,5μmol/L)As2O3处理MM细胞株NCI-H92948h后,HSP90乙酰化水平较对照组升高。HSP90乙酰化水平的增加抑制了其伴侣分子的功能,药物处理后HSP90与其客户蛋白IKKα的结合能力减弱,IKKα在细胞内表达减少。 结论不同浓度As2O3处理后增加了HSP90的乙酰化,抑制了其伴侣分子的功能,影响了客户蛋白的表达。