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上海地区儿童病毒性腹泻分子流行病学研究

龚智翔  
【摘要】: [研究背景]2008年WHO报告全球每年因腹泻死亡的5岁以下儿童达187万,占儿童死亡总数的19%,且78%分布在非洲和东南亚发展中国家。二十世纪70年代之前,有关感染性腹泻的病原学研究,绝大多数为细菌和寄生虫。随着检测技术的不断发展,70年代之后,相继发现诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠腺病毒、札如病毒是引起急性水样泻的主要病因。上述病毒导致的感染性腹泻称病毒性腹泻,在儿童感染性腹泻中占大多数,目前尚无有效的药物治疗,接种相关疫苗可能是控制此类疾病的有效的方法。但在制备及使用疫苗过程中,我们都必须对致病病毒的流行病学资料有一个充分的认识。近几年国内对病毒性腹泻的流行病学研究已开展,但是上海地区尚未见全面深入的病毒性腹泻分子流行病学研究报告。因此我们前瞻性地收集2008年8月至2009年7月的腹泻患儿标本进行相关病毒的分子流行病学研究。 本研究共分为三部分:(一)部分腹泻病毒基因诊断方法的建立与优化;(二)上海地区儿童病毒性腹泻病原学调查;(三)上海地区腹泻病毒的基因型分布及核酸序列分析。 第一部分部分腹泻病毒基因诊断方法的建立与优化 目的①建立快速灵敏的人星状病毒基因检测方法,为人星状病毒的检测提供技术支持。②改良诺如病毒普通RT-PCR方法以便利于扩增产物的直接测序。材料与方法①下载Genbank中所有人星状病毒全基因序列以及衣壳区序列,进行多重比对,寻找保守区,使用引物探针设计软件结合实际检测情况对所选引物和探针进行评价。将建立的一步法Taqman探针实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR进行比较。②在扩增诺如病毒的原始文献的基础上对其兼并引物进行改进,使用诺如病毒阳性标本的倍比稀释液进行改进后的检测评价结果①所建立的星状病毒一步法实时荧光RT-PCR比常规RT-PCR敏感1000倍,特异性良好。②改良后的引物扩增灵敏度和原引物无差别,但改良后引物扩增后产物可直接进行测序,而原引物扩增产物需克隆测序。结论①建立了一种一步法实时荧光RT-PCR方法可应用于星状病毒的基因检测。②改良了诺如病毒普通RT-PCR引物使得其扩增产物可直接用于测序。 第二部分上海地区儿童病毒性腹泻病原学调查 目的了解上海地区儿童各种病毒性腹泻流行病学情况,为病毒性腹泻防治提供背景资料。材料与方法随机抽样采集上海儿科医院2008年8月至2009年7月患有急性腹泻病儿童的粪便标本共910份,胶体金法检测轮状病毒,病毒DNA/RNA共抽提试剂盒抽提核酸,使用一步法实时荧光RT-PCR检测诺如病毒基因型GⅠ和GⅡ,札如病毒,人星状病毒,实时荧光RT-PCR初步检测腺病毒,并用普通PCR再次对腺病毒阳性标本进行检测。结果轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒和腺病毒全年检出率分别为29.5%,18.1%,6.5%,3.3%和6.5%。轮状病毒以10,11,12,1月份检出率较高,在38.0%-70.5%之间,在春夏季节亦有检出,检出率在10.5%-29.5%之间。诺如病毒全年可见散发,但在2008年8月、9月和2009年7月有明显的流行高峰。札如病毒、星状病毒和腺病毒感染未发现有明显季节分布特点。轮状病毒腹泻患儿主要集中在3岁以下婴幼儿,占全部此类患儿的91.0%。绝大部分诺如病毒感染的儿童(94.0%)小于3岁。大部分札如病毒(88.1%)、星状病毒(85.5%)和腺病毒感染的儿童(98.3%)小于5岁。结论轮状病毒和诺如病毒是上海地区儿童病毒性腹泻的最主要病原体,札如病毒、星状病毒和腺病毒为常见病原体。轮状病毒流行高峰为秋冬季,诺如病毒流行高峰为夏秋季,札如病毒、星状病毒和腺病毒感染没有明显的季节分布特点。5岁以下儿童为病毒性腹泻的易感人群。 第三部分上海地区腹泻病毒的基因型分布及核酸序列分析 目的了解各种病毒性腹泻的分子流行病学特点,明确各种病毒分子特征及基因型流行分布情况,为疫苗的研发提供基础数据。材料与方法分别对第二部分各种病毒检测阳性的标本进行病毒基因分型,其中轮状病毒采用多重巢式RT-PCR结合琼脂糖凝胶电泳进行G分型和P分型,而诺如病毒、札如病毒、星状病毒和腺病毒使用直接测序,构建分子进化树的方法进行基因分型。此外,诺如病毒和札如病毒进行两个不同区域的测序并进行重组分析。结果①轮状病毒G分型以G1最多,占33.7%,以下依次为G3(20.8%),混合型(20.2%),G2(14.6%),G9(6.7%),G4(2.2%)。P分型以P[8]为主,占77.8%,而P[4]占17.0%,其它少见分型占1.7%。②165份诺如病毒阳性衣壳区测序成功113份,65份(57.5%)为GⅡ.42006b变异株,35份(31.0%)GⅡ.3亚型,7份(6.2%)GⅡ.6,4份(3.5%)GⅡ.12,1份(0.9%)GⅡ.14,1份(0.9%)GⅡ.2,1份(0.9%)G 1.4,1份(0.9%)G 1.5。多聚酶区测序成功102份,96份为GⅡ.4(64份GⅡ.42006b株,33份其他GⅡ.4型),2份GⅡ.2,2份GⅡ.3,2份GⅡ.9。91份诺如病毒GⅡ株衣壳区和多聚酶分型都成功,58份(63.7%)为GⅡ.4/GⅡ.4,25份(27.5%)GⅡ.4/GⅡ3,2份(2.2%)GⅡ.6/GⅡ.9,2份(2.2%)GⅡ.6/GⅡ.4,2份(2.2%)GⅡ.12/GⅡ.3,1份(1.1%)GⅡ.12/GⅡ.4,1份(1.1%)GⅡ.2/GⅡ.2。1份(1.1%)GⅠ.4。③59例札如病毒阳性标本使用SR80/JV33测序成功13份,SLV5317/SLV5749测序成功14份,其中有8份两者均成功。综合基于两区的分型方法,共发现8份GⅠ.1,4份GⅡ.1,3份GIV,1份G I.2,1份G I.3,1份G I.3和1份GⅠ.8。其中同时扩增成功的8份标本使用两种分型方式结果一致。④30份星状病毒阳性标本测序成功20份,1型(12/20,60%),4型(8/20,40%),1型又可分为3个系谱lb,1d和1a,以系谱1b为主,4型都归属于一个系谱4a。⑤59份腺病毒阳性标本测序成功58份,分子进化树显示32份(55.2%)为血清41型,2份(3.4%)为血清40型,9份(15.5%)为血清2型,5份(8.6%)为血清3型,4份(6.9%)为血清1型,3份(5.2%)为血清31型,1份(1.7%)为血清15型,2份(3.4%)未能分型。结论①上海轮状病毒流行株与其他国家大致相同,目前上市的疫苗毒株血清型基本包含上海流行株。目前G1P[8]为上海主要流行株。②GⅡ.42006b变异株为目前优势株,但重组株GⅡ.4/GⅡ.3可能已经在上海乃至全国广泛传播。③上海地区存在多种型别的札如病毒,但目前尚未发现存在重组札如病毒株。④星状病毒在上海地区除了常见的血清1型外,血清4型亦比较多见。⑤腺病毒中血清41型为最主要流行型别,血清31型可能也是病毒性腹泻的病原体之一。


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