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调控ACE2表达对糖尿病肾病Ⅰ型胶原代谢的影响及作用机制研究

卜乐  
【摘要】: 第一部分过表达ACE2基因的阳性MES13s克隆的建立 目的:构建过表达ACE2基因的MES13s阳性克隆并进行鉴定。 方法:通过PCR扩增,双酶切鉴定、测序验证重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ACE2并将重组真核表达载体稳定转染MES13s。转染pcDNA3.1(-)-ACE2的MES13s经G418筛选后,随机挑选克隆,用RT-PCR和Western blot鉴定该细胞克隆ACE2mRNA和蛋白表达。 结果:PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,条带大小为2.0kb,与预期条带大小一致。将PCR反应产物ACE2片段经酶切纯化后插入对应位点,转化感受态菌后随机挑选3个克隆,抽提质粒并经XbaⅠ和PmeⅠ进行酶切鉴定,片段大小亦为2.0kb。随机挑选3号重组转化子测序,将上下游序列拼接后与ACE2标准序列对比,证实ACE2片段已正确插入pcDNA3.1(-)载体。 重组转化子转染MES13s后,RT-PCR验证:转染pcDNA3.1(-)-ACE2的MES13s,特异性的条带大小与预期相同(7428 bp),空白质粒转染MES13s条带大小为5427bp。Western blot结果表明在pcDNA3.1(-)-ACE2转染的细胞中,可见一条90 kDa的条带。进一步验证了pcDNA3.1(-)-ACE2融合蛋白的表达,而在对照组和空白质粒转染组未发现该融合蛋白表达。 结论:成功构建了pcDNA3.1(-)-ACE2重组真核表达质粒。并将pcDNA3.1(-)-ACE2重组转化子稳定转染MES13s。阳性克隆的MES13s中ACE2 mRNA和蛋白表达明显增强。 第二部分ACE2基因对MES 13s I型胶原代谢的影响及可能的作用机制 目的:研究转染ACE2基因是否能通过阻断AngⅡ-AT1R-PI3K-Akt通路,干预Ⅰ型胶原代谢及其通路中可能的中间环节。 方法:予AngⅡ不同浓度或不同时间的刺激,观察其对Ⅰ型胶原mRNA合成水平的刺激作用强度,摸索最佳作用浓度和作用时间。予AngⅡ不同时间的刺激,观察其对Akt蛋白磷酸化的作用强度,摸索最佳作用时间。予AngⅡ刺激转染ACE2基因的MES13s,以及AngⅡ与AT1R、PI3K、Akt、AC、PKA、Epac、Src激酶、TGFβRI抑制剂或阻断剂共同刺激MES13s后,Western blot法检测Ⅰ型前胶原和Akt蛋白磷酸化的水平。 结果:予AngⅡ(0.1μM)予MES13s刺激1.5-24h时,RT-PCR法检测Coll-1α1,Coll-1 a 2 mRNA水平明显增高。浓度为0.1μM的Ang II刺激时,Coll-1α1 mRNA水平增高最明显。予MES13s以AngⅡ(0.1μM)刺激2min时,Western blot法检测Akt蛋白磷酸化水平最高。 Western blot法检测Ⅰ型前胶原蛋白和Akt蛋白磷酸化的水平,结果发现与MES13s相比,pcDNA3.1(-)-ACE2质粒转染MES 13s组两种蛋白表达均明显降低。AT1R、PI3K、Akt、AC、Epac、Src激酶、TGFβRI抑制剂或阻断剂亦能显著降低上述两种蛋白的表达。PKA抑制剂作用组上述两种蛋白表达无显著改变。 结论:转染ACE2基因能够阻断AngⅡ-ATIR-PI3K-Akt介导的Ⅰ型胶原合成。Src激酶、TGFβRI和不依赖PKA的Gα5-cAMP-Epac通路参与了AngⅡ-AT1R-PI3K-Akt介导的Ⅰ型胶原合成。 第三部分AT1R拮抗剂调控ACE2基因干预糖尿病大鼠肾脏Ⅰ型胶原代谢的体内研究 目的:研究AT-1R拮抗剂对DM大鼠肾脏功能和结构的治疗改善作用,探讨其对ACE2蛋白和Ⅰ型前胶原的干预作用及其之间可能存在的相互关系。 方法:将STZ诱导的糖尿病大鼠,根据体重和血糖随机分成糖尿病对照组(DM组)和糖尿病ARB治疗组(DM+ARB)。造模前预设了鼠龄、体重相匹配的正常组(NC组)。第8周起,造模成功后,予DM+ARB组氯沙坦10mg/kg,每天灌胃一次。检测血糖、糖化血红蛋白和体重等一般指标以及肾重/体重(KW/BW)、内生肌酐清除率(Ccr)、24小时尿量(24UV)、24小时尿蛋白定量(24Upro)等肾功能指标。HE染色切片光镜下观察肾小球病理改变,免疫组化法检测ACE2和Ⅰ型前胶原蛋白表达。 结果:与NC组相比,DM组、DM+ARB组大鼠血糖、糖化血红蛋白显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。与NC组相比,DM组、DM+ARB组大鼠体重显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。与DM组相比,、DM+ARB组大鼠KW/BW、Ccr、24UV、24Upro显著降低,差异有统计学意义(P0.05) 结论:AT-1R拮抗剂对DM大鼠的体重、血糖、糖化血红蛋白等一般指标无明显影响,但能够显著改善其KW/BW、Ccr、24UV、24Upro等肾功能指标,并减轻肾小球的病理学改变。并且AT1R拮抗剂可增加ACE2蛋白表达,减少Ⅰ型前胶原蛋白表达。提示AT1R拮抗剂可能对ACE2基因存在正向调控的作用,这也可能是其介导阻断胶原合成的机制之一。


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