大鼠脊髓损伤后Nogo蛋白受体在浸润巨噬细胞中的表达及作用

【摘要】： 轴突再生并与靶细胞形成功能性突触结构是脊髓损伤修复的主要目标和关键问题,目前大量促进轴突再生的基础研究显示成体哺乳动物中枢神经系统损伤早期再生失败的主要原因是由于髓鞘抑制物的存在。我们在前期实验中发现,将神经干细胞和(或)嗅鞘细胞移植到受损脊髓局部,可观察到神经干细胞可分化为神经元及其它神经胶质细胞,神经突触形成增加,并观察到脊髓全横断损伤大鼠BBB运动功能评分改善,尽管实验中观察到不少受损神经再生或(和)出芽(待发表资料),但受损局部微环境的改变使轴突再生或出芽的距离极为有限,难以冲破髓鞘抑制因子与胶质瘢痕形成的屏障与远侧断端形成有功能突触。 髓鞘碎片中的某些特异性成分(比如：Nogo66、髓鞘相关糖蛋白MAG、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白OMgp等)作用于轴突上的Nogo受体(NgR)及其共受体p75NTR复合物,通过小鸟嘌呤核苷三磷酸酶(small GTPase) Rho途径调节轴突内细胞骨架结构抑制轴突生长,从而使脊髓损伤修复难以获得满意结果。Nogo单克隆抗体IN-1可以拮抗Nogo的抑制作用,但无法与另外两种抑制物MAG和OMgp结合。GrandPre等尝试以竞争性短肽NEPI-40来拮抗NgR的作用,结果显示NEP1-40可对抗Nogo-66诱导的轴突生长抑制,但对除Nogo-66外的其他髓鞘抑制物不敏感,使其在体内应用的效果并不十分理想,表明该短肽并不能封闭NgR所有与抑制分子结合的位点。因此,找到一种有效且靶向性强的髓鞘碎片清理方法成为当务之急。 目前,人们对巨噬细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用存在着两种截然相反的观点,一种认为巨噬细胞对轴突生长有抑制作用；而另一种则认为巨噬细胞对轴突的再生起到促进作用。在整个机体组织的修复过程中,炎性反应贯穿始终,而炎性细胞中,巨噬细胞发挥了主要作用,它能清除坏死组织并分泌营养因子,并可在机体组织修复中起着重要作用。Mantovani等认为,巨噬细胞受炎性反应中微环境不同信号影响,可转变为“选择”活化型和“经典”活化型两种。“选择”活化型巨噬细胞由IL-4和糖皮质激素诱导转换而来,可调整免疫炎性反应的过程,清除坏死组织的残片,促进血管再生组织修复和重建；“经典”活化型巨噬细胞可分泌前炎性细胞因子,加重炎症反应,对受损局部细胞造成更进一步的损害。近年来,对于巨噬细胞在脊髓损伤致伤及修复作用报道并不多见。 新近研究表明巨噬细胞在髓鞘碎片吞噬、促进轴突再生及再髓鞘化过程中发挥的作用可能比我们预想的更大。 1998年,Zeev-Brann报道成熟哺乳动物中枢神经系统损伤后的自我修复中出现脊髓衍生炎性细胞,Buss与Schwab等研究发现SCI大鼠髓鞘碎片清理细胞ED-1免疫组织化学染色呈阳性反应,即为小胶质细胞与巨噬细胞。MASAAKI通过鼠脊髓挫伤模型(代表挫伤引起的有髓鞘碎片和髓鞘再生受抑制)与化学性脱髓鞘模型(代表早期髓鞘碎片清除和髓鞘再生的多发性硬化症)的对比,研究了巨噬细胞聚集及其作用,作者使用绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓细胞分别移植到经放射线照射的脊髓挫伤模型鼠与化学性脱髓鞘模型鼠尾静脉,通过损伤脊髓免疫组化染色研究活化巨噬细胞的浸润和残留髓鞘碎片的不同水平变化,结果显示表达绿色荧光蛋白的活化巨噬细胞构成损伤局部主要细胞群,表明两个模型中的巨噬细胞主要来源于骨髓,很少来源于内在的小胶质细胞。在免疫染色显示在挫伤模型当中,髓鞘碎片长时间持续存在,并且活化巨噬细胞的浸润在挫伤模型中比化学模型中更慢并且数目显著减少,同时伤后2～4天RT-PCR检测趋化因子(MCP-1, GM-CSF)低水平表达,提示活化巨噬细胞浸润的延迟与挫伤性脊髓损伤后髓鞘碎片的持续存在有关,且导致髓鞘再生抑制。 Samuel David等研究了Nogo受体(NgRs)在周围神经损伤中的作用。研究人员损伤鼠坐骨神经,他们发现,一旦巨噬细胞到达受损部位并开始清除工作,它们就表现为表面表达NgR1的活化形式,并进入施旺细胞细胞基底部。当恢复的神经开始产生新的蛋白质髓鞘(表达NgR配体如MAG等),这种受体不但抑制巨噬细胞与髓鞘的结合,还会直接抑制髓鞘的形成,当研究人员再次损伤神经,使髓鞘不能形成时,巨噬细胞继续留在受损神经外层施旺细胞细胞基底部吞噬髓鞘碎片。然而,NgRl基因敲除鼠坐骨神经或使用Y-27632抑制NgR下游Rho相关激酶,可增加巨噬细胞与髓鞘的结合率,证实巨噬细胞表达的NgR参与介导该细胞在周围神经损伤修复中的撤离过程。有关中枢神经系统损伤中巨噬细胞是否表达NgR及二者在中枢神经系统尤其是脊髓损伤修复中的作用有待进一步研究。 脊髓损伤后,活化的巨噬细胞浸润脊髓损伤区,髓鞘碎片的清除延缓导致了轴突延伸的抑制,和由于星形胶质细胞的堆积形成的瘢痕导致了轴突再生的抑制。我们推测,成年哺乳动物脊髓损伤后,活化巨噬细胞迅速清除髓鞘碎片对中枢神经系统的再生与对周围神经系统的再生具有同样重要的意义,但对于巨噬细胞在脊髓损伤中的具体作用仍需深入研究。 研究目的 制备大鼠脊髓损伤模型,分离、培养、鉴定大鼠脊髓损伤局部浸润的巨噬细胞,观察其是否表达NgR；构建大鼠NgR基因慢病毒载体并转染巨噬细胞表达NgR,探讨转染免疫细胞的可行性；比较NgR的表达对巨噬细胞吞噬功能的影响；体外构建神经元损伤模型,将表达NgR的巨噬细胞、空载组巨噬细胞及不表达NgR的普通巨噬细胞与损伤的神经元细胞共同培养,比较各组巨噬细胞对损伤神经元修复、存活、分化的影响,探讨表达NgRs的巨噬细胞在脊髓损伤修复中的可能作用机制,为进一步动物研究及临床应用提供实验和理论依据。 内容和方法 (一)制备大鼠脊髓损伤模型,第3天及第7天时取材,使用免疫荧光化学染色观察巨噬细胞浸润及NgRs的表达情况。用酶消化法分离,获取损伤脊髓组织局部浸润的巨噬细胞,使用双标免疫荧光化学染色从细胞水平观察巨噬细胞表达NgRs情况； (二)采用RT-PCR技术获得大鼠NgR基因编码区片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒,在脂质体介导下包装质粒,包膜质粒共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠巨噬细胞后,PCR检测巨噬细胞中NgR基因的插入和表达。 (三)将髓鞘碱性蛋白(MBP)加入转染NgRs的巨噬细胞、空载组巨噬细胞和未转染NgRs的巨噬细胞培养皿中,Western blot定量检测巨噬细胞吞噬的MBP量,行t检验(Student's t-test),取α=0.05。 (四)制备体外神经元损伤模型,将表达NgR的巨噬细胞、空载组巨噬细胞及不表达NgR的普通巨噬细胞与损伤的神经元细胞共同培养,各组分别于损伤后30min、1h、6h、12h、24h、48h、72h各时间点提取培养液100 u L,检测LDH含量并采用MTT比色法测量其存活细胞的吸收值。倒置相差显微镜下观察各组不同时间神经元的形态变化,采用重复测量数据方差分析进行统计学分析。 研究结果 (一)在假手术组中,脊髓组织中没有浸润的巨噬细胞；免疫荧光染色显示脊髓损伤3天后浸润的巨噬细胞表面可表达NgR,伤后7天时表达NgR的巨噬细胞的数量明显增多。培养脊髓损伤局部浸润的巨噬细胞,免疫荧光染色显示该细胞NgRs抗原染色阳性； (二)所获的NgR基因经测序后与Gen Bank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×107Tu/mL, PCR证实NgR基因插入病毒基因组。感染巨噬细胞后RT-PCR检测试验组NgR-巨噬细胞组更大量表达NgR,与其余2组(Mock-巨噬细胞组、巨噬细胞组)比较差异具有统计学意义； (三)NgR转染巨噬细胞组的MBP含量比非转染组MBP含量明显增加,差异有显著统计学意义(P0.05),空载组与非转染组无明显的差异(P0.05)； (四)表达NgR的巨噬细胞、空载组巨噬细胞及不表达NgR的普通巨噬细胞与损伤的神经元细胞共同培养0.5,1,6,12小时后,各组OD值没明显不同。24h后,神经损伤+NgR转染组比其他组有明显的差异(P0.05),空载组与非转染组没明显的差异(P0.05),NgR转染组与正常神经组无明显差别(P0.05)。随时间延长,LDH水平在损伤神经组中下降明显但在NgR转染组下降不明显；培养0.5,1,6,12h后,各组OD值没明显差别；24h后,神经损伤+NgR转染组与其他组比较有明显的差异(P0.05),空载组与非转染组没明显的差异(P0.05),NgR转染组与正常神经组无明显差别(P0.05)。 实验结论 成功制备脊髓损伤模型,从组织学和细胞水平证实损伤脊髓组织局部浸润的巨噬细胞表面有NgRs的表达；成功构建大鼠NgR基因慢病毒载体并转染巨噬细胞表达NgRs,为今后移植基因修饰的巨噬细胞治疗脊髓损伤奠定了基础；表达NgRs的巨噬细胞体外能促进损伤神经元的修复,其机制可能是巨噬细胞通过表达的NgRs介导胞内信号途径调节巨噬细胞的吞噬功能,从而为神经再生创造条件。这为脊髓损伤的治疗研究提供了一个新的解决途径,也为进一步动物研究和临床应用奠定了可靠的实验基础和理论依据。