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化学计量学辅助GC-MS用于辛夷挥发油化学成分和抗炎作用机制研究

曲丽萍  
【摘要】: 针对中药复杂体系定性定量分析与药效机制研究方面面临的瓶颈问题,本课题以辛夷挥发油为研究对象,应用气相色谱-质谱联用分析手段,结合化学计量学方法及代谢组学研究技术,对辛夷挥发油的组成、药代动力学、药效学、作用机制等进行了全面、系统的研究,为揭示辛夷挥发油药效物质基础提供了依据,对于含有辛夷的中药复方的药效学研究亦具有一定的借鉴意义。 具体研究内容如下: 1.气相色谱中目标色谱峰保留时间的预测 先是基于恒温及一阶程序升温条件下目标色谱峰的保留时间,对一阶程序升温条件下另一升温速率的该目标色谱峰保留时间进行预测。结果表明,预测值和测量值的相对偏差较大;然后,在一阶程序升温条件下,用两个不同升温速率下目标色谱峰的保留时间来预测另一速率下的保留时间,预测值与实测值较为接近,只有个别组分相对偏差大于1%,其它相对偏差较小。比之在恒温下对目标色谱峰保留时间的预测值来说,相对偏差明显减小。 基于实际需要,建立了可用于二阶及多阶程序升温的目标色谱峰保留时间预测的方法。先以标准对照品为研究对象,预测正十六酸和二十九烷在二阶程序升温条件下的保留时间。结果显示,预测值与实测值的相对偏差小于0.2%。然后以辛夷挥发油成分为考察目标,相对偏差小于0.15%,预测结果满意。并对一阶和二阶程序升温条件下保留时间预测相对偏差进行了比较。结果显示,二阶条件下的预测值和真实值更为接近。该预测方法可用来优化气相色谱条件,节省分析时间,提高分析效率,在实际工作中具有较好的应用价值。 2.化学计量学分辨技术和联用色谱技术用于辛夷挥发油的复杂成分分析 通过GC-MS联用,结合直观推导式演进特征投影法(HELP)对辛夷挥发油的成分进行了定性和定量分析。以重叠色谱峰簇A和B为例,在解析过程中,先后使用FSMWEFA,ELPG和HELP方法,对重叠色谱峰进行了解析。解析结果显示:峰簇A是含有三组分的峰簇,峰簇A中的三个化合物分别为o-Cymene,D-Limonene和Eucalyptol,相对含量分别为2.27%,4.52%,14.20%;峰簇B经FSMWEFA法解析是4组分体系,但2D-ELPG显示为3组分体系,为进一步确定体系组分数,采用3D-ELPG方法进行确认后,峰簇B包括四个化合物,解析结果和NIST数据库比对后,确认分别是Carotol,τ-Cadinol,τ-Muurolol和1á-Cadin-4-en-10-ol,相对含量分别是0.13%,1.41%,1.01%,0.41%。采用此策略对辛夷挥发油进行解析后,化合物由原来直接由NIST检索的65个增加至80个。 在本研究中,我们充分利用了3D-ELPG的信息,解析结果更为准确可靠。可以看出,GC-MS联用结合HELP方法可成功的用于分析辛夷挥发油成分,也充分说明化学计量学在分析复杂体系中具有潜在的优势,可提高组分定性和定量的准确性。 3.辛夷挥发油成分GC-MS指纹图谱的建立 通过多元曲线分辨-偏最小二乘法(MCR-ALS)对12批辛夷挥发油的重叠色谱峰进行了批量解析,增加了定性定量的准确性;确定了12批样品中辛夷挥发油的共有组分及含量,确定了辛夷挥发油中最主要的化合物,包括桉油精,异合金欢醇,α-水芹烯,崁烯,柠檬烯,α-杜松醇,α-芳樟醇,石竹烯,邻聚伞花素等。采用n强峰、共有峰率及变异率对指纹图谱进行了评价,建立的方法稳定、可靠,较为全面的反映了辛夷挥发油的化学成分,为辛夷药材质量标准奠定了基础。 4.辛夷挥发油中主要活性成分1,8-桉叶素的药代动力学初步研究 以1,8-桉叶素为研究对象,采用液-液萃取法提取血浆样品,建立了以α-蒎烯为内标的气相色谱法检测血浆样品中1,8-桉叶素浓度的方法。色谱分离条件为毛细管柱:SPBTM-1,0.25 mm×30 m×0.25μm;FID检测器;载气:氮气,流速1.0 mL/min;程序升温条件:起始柱温50°C,保持2 min,再以5°C /min的速率升温至100°C,保持2 min。采用本文建立的生物样品预处理方法和气相色谱法测定样品中1,8-桉叶素的含量,生物样品预处理方法回收率高,色谱分离选择性好。本法的准确度、精密度、专属性和定量线性范围均达到体内药物分析的要求。线性相关系数为0.999,日内精密度范围是3.75~5.74%,日间精密度范围是2.41~5.58%。 用上述建立的气相色谱法测定血浆中1,8-桉叶素的浓度,根据所得的血药浓度-时间曲线,采用非房室模型推算药物动力学参数。结果表明,SD大鼠口服1,8-桉叶素后体内血药浓度消除较慢,个体差异较大。经非房室模型法估算的SD大鼠口服给药后达峰时间为2h,达峰浓度为36.223μg/ml,药时曲线末端相消除半衰期为4.811h,平均滞留时间为7.923h,AUC0~12和AUC0~∞分别为227.09μg·h/ml,280.06μg·h/ml。 5.辛夷挥发油抗炎作用的代谢组学初步研究 首先建立角叉菜胶致大鼠急性炎症模型,然后从药效学角度证明辛夷挥发油具有较好的抗炎活性。然后采用GC-MS分析正常组、模型组及给药组的三种不同状态下大鼠的血浆代谢谱,采用NIST数据库对不同组别大鼠血浆中的内源性代谢物进行鉴定,使用多元模式识别方法分析大鼠不同组间的代谢物谱差异。在正常组和模型组的得分矩阵图中,两组的样本点完全分离,说明致炎后大鼠正常生理代谢被干扰,从机体生理内源性代谢物变化的层面可以认为炎症模型造模成功。在正常组、模型组及给药组的得分矩阵图中,三组的样本点也达到了分离,而对照组和给药组在第二主成分上毗邻,这表明给药组样本有向对照组移动的趋势。 从三组的载荷矩阵图中,可以得到对分类贡献较大的生物标记物。数据结果表明,模型组中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量升高,且尿素和尸胺对分类贡献最大,可认为是角叉菜胶致炎对大鼠机体生理内源性代谢产生扰动的生物标记物。给药组中尿素、戊二胺、甘氨酸及乳酸的含量下降,回到正常水平,而软脂酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、胆固醇的含量升高,且高于正常组,可认为是给药后的生物标记物。通过文献调研表明,这些标记物的改变和其抗炎活性存在一定的关系。这些脂肪酸及胆固醇可作为肝x受体的激活剂,并启动肝x受体信号通路从而发挥抗炎活性。


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