收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

2-氨基壬烷-6-甲氧基四氢萘盐酸盐(10b)体外抗真菌活性及作用机制研究

梁蓉梅  
【摘要】: 白念珠菌感染由于在艾滋病患者,器官移植患者以及其他免疫缺陷患者中具有高发病率和高死亡率的特点,已成为一个严重的医学问题。尽管抗真菌药物品种不断增加,但仍然满足不了病情复杂患者对控制感染越来越高的需求。本课题的研究目的是探讨具有新型化学结构的抗真菌化合物2-氨基壬烷-6-甲氧基四氢萘盐酸盐(10b)的体外抗真菌活性和作用机制,为降低真菌相关感染提供有用的信息和策略。微量液基稀释法结果显示10b对氟康唑敏感白念珠菌以及氟康唑耐药白念珠菌均有良好的抗真菌活性,MIC80值的范围从0.031μg/ml到8μg/ml,活性强与氟康唑或酮康唑相当或者更强;对氟康唑耐药白念珠菌的抗真菌活性强大,其作用普遍强于酮康唑,尤其对氟康唑高度耐药的实验室诱导白念珠菌SC5314R(对氟康唑和伊曲康唑都高度耐药,MIC80值均为256μg/ml)作用更加显著,MIC80值为0.125μg/ml。琼脂平皿纸片扩散实验进一步证实10b对氟康唑耐药白念珠菌的抗真菌活性强于氟康唑和酮康唑并且表现出一定的杀菌作用。生长曲线实验,半数抑菌浓度(IC50)测定以及最低杀菌浓度(MFC)测定等多种实验手段和方法均证实10b具有强大的体外抗真菌活性。结晶紫染色实验以及XTT还原分析实验考察了10b对白念珠菌生物被膜的影响,结果显示10b对白念珠菌生物被膜的形成以及成熟(48 h)白念珠菌生物被膜细胞代谢活性均有强大的抑制作用,并且抑制能力强于法尼醇。激光共聚焦显微镜观察也进一步证实了10b强大的抑制白念珠菌生物被膜的作用:正常白念珠菌生物被膜表现为主要由假菌丝和真菌丝组成的典型三维空间结构;当白念珠菌细胞在0h与10μM法尼醇共孵育48 h后,被膜的形成没有受到抑制,仍然主要由真菌丝和假菌丝组成;与0.1μM的10b共孵育48 h后,尽管真菌丝和假菌丝仍然能够观察到,但被膜典型的三维空间结构(相互缠绕的丝状结构和芽生孢子基底层)受到了破坏,被膜主要由酵母态细胞组成;当10b的浓度增加10倍(1μM),粘附细胞从酵母态向菌丝态的转变被彻底抑制,导致了被膜的消失或者仅能生成少量的全部由酵母态细胞组成的被膜。为了探讨10b对白念珠菌的作用机制,我们首先采用薄层色谱分析(TLC)和气相色谱-质谱联用(GC/MS)分析考察10b在麦角甾醇生物合成通路上的作用靶点,通过透射电镜观察10b处理后对白念珠菌超微结构的影响,然后采用cDNA芯片分析和realtime RT-PCR分析从分子水平上考察10b处理酵母态白念珠菌以及被膜态白念珠菌基因表达谱的变化,最后采用MTS/PMS还原分析法评价了10b的体外细胞毒性。TLC分析结果显示10b处理后的薄层色谱图上羊毛甾醇及其类似物的斑点与酮康唑处理后完全不同,前者斑点直径明显变小颜色变淡,甚至观察不到而后者与空白对照相比斑点直径显著增加,颜色变深,这说明10b可能抑制了麦角甾醇生物合成通路上羊毛甾醇C-14去甲基酶之外的其他酶,导致羊毛甾醇向其他中间甾醇的转化。GC/MS分析结果显示10b处理组在气相色谱图上出现了与酮康唑处理组完全不同的色谱峰,前者所产生的甾醇成分与erg24菌株所产生的甾醇成分完全相同,均以ergosta-8,14-dienol(ignosterol)作为主要甾醇同时伴随大量ergosta-8,14,22-trienol的产生而后者则以24-methylene-lanost-8-en-3-ol作为主要甾醇。因此,10b在麦角甾醇生物合成通路上的真正作用靶点可能是ERG24基因编码的甾醇C-14还原酶而不是ERG11基因编码的羊毛甾醇C-14去甲基酶。为了证实上述观点,我们比较了10b和甾醇C-14还原酶抑制剂丁苯吗啉(Fm)处理野生型白念珠菌(BWP17)以及erg24菌株(NJ51-2)所产生的甾醇成分种类及含量变化情况。虽然10b与吗啉类都属于甾醇C-14还原酶抑制剂,但两者在麦角甾醇生物合成通路上的作用机制仍然存在差异。吗啉类除抑制甾醇C-14还原酶外,还抑制由ERG2基因编码的甾醇C-8异构酶,因此丁苯吗啉处理的野生型白念珠菌(BWP17)除以ergosta-8.14-dienol(ignosterol)作为主要甾醇外,还出现ergosta-8-en-3-ol的堆积。由于甾醇C-8异构酶位于甾醇C-14还原酶下游,因此丁苯吗啉处理的erg24菌株(NJ51-2)所产生的甾醇种类及比例均与未处理的erg24菌株完全相同。10b处理的erg24菌株(NJ51-2)所产生的甾醇成分与未处理的erg24菌株(NJ51-2)所产生的甾醇成分完全相同,但两者ergosta-8,14,22-trienol与ignosterol的比例却不同。10b处理组所产生的ergosta-8,14,22-trienol量明显高于未处理组,这表明10b在麦角甾醇合成通路上除抑制甾醇C-14还原酶活性外,可能还存在另外一个靶点,并且这个靶点应该位于甾醇C-14还原酶的上游。通过ergosta-8,14,22-trienol与ignosterol比例变化规律,我们推测它可能是与甾醇C-5去饱和酶相关的一个酶。另外,我们发现ignosterol的量随着10b剂量的增加而增加,这表明10b在低浓度时甾醇C-5去饱和酶相关酶是主要的作用靶点;随着10b剂量增加,10b与甾醇C-14还原酶的结和力增强,最终使甾醇C-14还原酶成为占主导作用的靶点。尽管ERG24基因编码的C-14还原酶是酿酒酵母有氧生长所必须的,但白念珠菌erg24突变体却能够在正常有氧条件下在标准限定滋养培养基中生长。电镜观察结果也显示10b处理后细胞膜结构完整,光滑,边界清晰,无胞内物质外流进入胞膜和胞壁之间。这表明10b虽然能够抑制麦角甾醇生物合成通路上的甾醇C-14还原酶和甾醇C-5去饱和酶相关酶的活性,导致麦角甾醇含量急剧降低,但由于中间甾醇的替代作用并不能破坏细胞膜结构的完整性,也不能完全抑制白念珠菌细胞的生长。因此,除了抑制麦角甾醇合成通路上的作用靶点之外,10b强大的抗白念珠菌活性必然还存在更为重要的作用机制。酵母态白念珠菌芯片分析和Real-time RT-PCR分析结果显示10b处理后,能量代谢相关基因,包括糖酵解相关基因(PFK1,CDC19和HXK2),生醇发酵相关基因(PDC11,ALD5和ADH1)以及线粒体呼吸链复合物相关基因(CBP3,COR1和QCR8)的表达水平显著降低。实时荧光定量分析结果显示10b处理白念珠菌后能够显著增加内源性活性氧(ROS)的产生,并且能力强于咪康唑。线粒体功能分析结果表明10b处理后能够降低线粒体膜电位(ΔΨm),泛醌-细胞色素C还原酶(复合物Ⅲ)活性以及细胞内ATP的含量。另外,加入抗氧化剂抗坏血酸(ascorbic acid,AA)能显著降低10b的抗真菌活性。这说明线粒体有氧呼吸链的转换与内源性ROS产生的增加可能在10b抑制酵母态白念珠菌活性过程中起了重要作用。被膜态白念珠菌芯片分析和Real-time RT-PCR分析结果显示10b处理后菌丝特异性基因ECE1表达急剧降低,编码转录抑制因子Nrg1p的基因NRG1表达水平显著增加,这与10b抑制白念珠菌被膜形成的作用直接相关。另外,10b处理后还能引起能量代谢相关基因表达降低,包括糖酵解相关基因(HXK2和PFK1),生醇发酵相关基因(ADH1)以及内源性ROS清除相关基因(SOD5)表达水平显著降低。功能分析结果显示加入抗坏血酸能显著降低10b对成熟白念珠菌生物被膜细胞代谢活性的抑制效率。上述结果表明10b对白念珠菌被膜形成的抑制作用可能主要依赖于改变被膜形成相关基因的表达,阻断白念珠菌从酵母态向菌丝态的转变,最终破坏了白念珠菌生物被膜的形成;线粒体有氧呼吸链的转换与内源性ROS产生的增加可能是10b降低成熟白念珠菌生物被膜细胞代谢活性的重要作用机制。体外细胞毒试验结果表明:虽然10b剂量依赖性地抑制小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/C 3T3)以及人正常肝细胞(L-02)的代谢活性,但其对哺乳动物细胞的IC50值远远高于对真菌细胞的MIC50值,这为该类化合物能够继续深入研究提供了基本的安全保证。我们的实验数据为开发针对新的作用靶点,结构新颖的抗真菌药物,克服目前临床日益严重的真菌感染,提供了有意义的信息。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王睿;;白念珠菌生物被膜耐药研究进展[J];中国药物应用与监测;2007年05期
2 陆文铨;曹颖瑛;陈海生;姜远英;;蒺藜中甾体皂苷TTS-12对白念珠菌生物被膜形成的抑制作用[J];第二军医大学学报;2010年02期
3 李虹;黄欣;施伟民;;中草药抗真菌研究新进展[J];中国真菌学杂志;2009年01期
4 吴建华;;抗真菌研究的新领域——药物增效剂[J];中国真菌学杂志;2011年03期
5 陈卫平,刘丽琳,杨济秋;N-(6,6-二甲基-2-庚烯-4-炔基)-N-甲基-α-取代-1-(4-取代)萘甲胺类的合成及抗真菌活性[J];药学学报;1989年12期
6 陈杰鹏;段丽丽;陈鸿锐;洪琳;李卫潘;罗建光;孔令义;;维康芬净及其衍生物的抗真菌活性研究[J];中国抗生素杂志;2009年01期
7 韩华;易杨华;喇明平;阎澜;刘宝姝;;糙海参皂苷Scabraside A、B的抗真菌和抗肿瘤活性[J];中国药理学通报;2008年08期
8 张瑞峰;冉玉平;王鹏;代亚玲;;1%萘替芬-0.25%酮康唑乳膏与2%酮康唑乳膏和1%特比萘芬乳膏的体外抗真菌谱及抗真菌活性对比研究[J];中国循证医学杂志;2011年05期
9 赵强,张军东,曹永兵,陈海生,姜远英;气质联用技术定量研究TTS-12对白念珠菌甾醇合成途径的影响[J];药学服务与研究;2005年02期
10 李莹;李德东;王彦;刘凌聪;黄海;付守廷;姜远英;;白念珠菌IFD6基因高表达促进生物被膜形成[J];第二军医大学学报;2010年06期
11 黄海;王彦;李莹;许懿;姜远英;;白念珠菌的应激反应与耐药性[J];第二军医大学学报;2010年11期
12 周宇;俞世冲;王保刚;闫永正;吴秋业;;1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-取代-2-丙醇类化合物的合成及抗真菌活性[J];第二军医大学学报;2011年07期
13 梁蓉梅;曹永兵;姜远英;;新型抗白念珠菌药物的作用靶点[J];第二军医大学学报;2006年09期
14 李红宾;何黎;王正文;李玉叶;黄云莉;;氢化可的松影响白念珠菌对抗真菌药物敏感性的实验研究[J];中国麻风皮肤病杂志;2007年05期
15 陈孙孝,温海,姚志荣,邓安梅,仲人前,廖万清;白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定[J];第二军医大学学报;2001年11期
16 崔颖;;大戟属植物Euphorbiacharacias胶乳对酮康唑抗白念珠菌的增效作用[J];国外医药.植物药分册;2002年06期
17 莫冰,傅颖媛,曾小平,况南珍,黄孝天;抗白念珠菌感染特异性免疫实验研究[J];中国皮肤性病学杂志;2003年02期
18 叶夏云,骆志成,武三卯,李文竹,周晓黎,薛晓云;白念珠菌细胞外磷脂酶活力与其对氟康唑耐药性之间关系的研究[J];西北国防医学杂志;2004年02期
19 张玉昆,唐英春,张扣兴;大肠埃希菌和白念珠菌混合感染小鼠中性粒细胞和巨噬细胞功能的研究[J];中国抗感染化疗杂志;2004年02期
20 付萍,刘晓莉,李学平;白念珠菌磷脂酶与其毒力关系的研究[J];临床皮肤科杂志;2005年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李红宾;何黎;王正文;李玉叶;黄云莉;;氢化可的松影响白念珠菌对抗真菌药物敏感性的实验研究[A];中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2006年
2 阎澜;李妙海;曹永兵;高平挥;王彦;姜远英;;白念珠菌耐药新蛋白——交替氧化酶[A];药学发展前沿论坛及药理学博士论坛论文集[C];2008年
3 徐永豪;李春阳;;耐氟康唑白念珠菌所致外阴阴道念珠菌病1例[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年
4 陈兴;侯天文;白云;李玮;陈晶;郭晓丽;刘艳丽;;住院患者念珠菌菌尿的调查[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年
5 张欣;苏雯静;李巍;安金刚;刘玉峰;;单克隆天然抗体3B4抑制白念珠菌芽管形成的机制初探[A];中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2006年
6 郭仁勇;;白念珠菌聚苯乙烯黏附增强基因1的研究进展[A];2008年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2008年
7 刘泽虎;吕雪莲;吕桂霞;沈永年;徐宏彬;陈伟;胡素泉;刘维达;;烟曲霉选择性培养基的实验研究[A];2008全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2008年
8 贾鑫明;曹永兵;王彦;姜远英;;白念珠菌RTA2是钙调神经磷酸酶通路介导的耐药性产生的靶基因[A];药学发展前沿论坛及药理学博士论坛论文集[C];2008年
9 陈官芝;马海丽;;念珠菌黏附特性对比研究[A];2007中华医学会第二次医学真菌学术会议暨医学真菌实验室研究技术新进展学习班论文汇编[C];2007年
10 秦晓峰;吴建华;黄懿;张丽娟;姜远英;顾军;;微量稀释法测定白念珠菌对氟康唑的MIC值及两种药敏试验的比较[A];2008全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 梁蓉梅;2-氨基壬烷-6-甲氧基四氢萘盐酸盐(10b)体外抗真菌活性及作用机制研究[D];第二军医大学;2010年
2 王琳;白念珠菌耐药相关蛋白Rta2p与脂筏关系研究[D];第二军医大学;2012年
3 许懿;小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究[D];第二军医大学;2010年
4 张军东;抗真菌天然产物的筛选与分子机制研究[D];第二军医大学;2006年
5 吴秀祯;双联苄类化合物羽苔素E的抗真菌机制[D];山东大学;2010年
6 曹颖瑛;白念珠菌生物被膜形成相关基因的功能研究[D];第二军医大学;2005年
7 郭娜;呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究[D];吉林大学;2009年
8 闭兴明;麝香草酚抗真菌活性及麝香草酚对酿酒酵母表达谱影响的研究[D];吉林大学;2008年
9 孙玲美;天然产物的抗真菌和抗肿瘤活性及机制研究[D];山东大学;2011年
10 汪洋;猪链球菌生物被膜形成及致病机理研究[D];南京农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 董玲玲;生物被膜型白念珠菌代谢物分析及代谢变化的初步研究[D];第二军医大学;2010年
2 商庆华;鱼腥草素钠抗白念珠菌的作用及机制研究[D];福建中医药大学;2012年
3 卢赛飞;链霉菌182-2抗真菌活性物质的分离及抑菌特性的初步研究[D];山西大学;2011年
4 孙漩嵘;白念珠菌新基因IPF19998的氧化还原相关功能研究[D];第二军医大学;2010年
5 赵炯;中药抗真菌活性测定和酵母利用非发酵碳源基因的筛选[D];天津大学;2007年
6 王慧;白念珠菌中耐药相关代谢物的比较代谢组学研究[D];第二军医大学;2012年
7 刘朝红;汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌生物膜增效活性的初步研究[D];暨南大学;2010年
8 陈文峰;双组份信号转导系统抑制剂体外抗白念珠菌活性的研究[D];福建医科大学;2011年
9 钟毅;白念珠菌苹果酸脱氢酶的结构及功能初步研究[D];中山大学;2012年
10 张蕾;紫外线对白念珠菌生长的影响[D];福建医科大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 特约撰稿 蔡德山;抗真菌七雄威力不减[N];医药经济报;2011年
2 邹先彪;白念珠菌感染的预警[N];大众卫生报;2005年
3 北京朝阳医院 张洪玉教授;生物被膜病在作怪[N];健康报;2000年
4 张洪玉;生物被膜病与慢性肺部感染[N];中国高新技术产业导报;2001年
5 中南大学湘雅医院 曾立明;细菌盖“棉被”药物难显效[N];大众卫生报;2004年
6 李聪然 钱皎;密度感知系统研究——为控制PA耐药提供新思路[N];中国医药报;2007年
7 浙江大学医学院附属第一医院 俞云松;铜绿假单胞菌耐药全国流行[N];健康报;2008年
8 中国医科院皮肤病研究所教授 吴绍熙;从误诊病例谈临床思维[N];健康报;2007年
9 张中桥;AMCase基因突变体克隆成功[N];中国医药报;2006年
10 健康时报实习记者  梁璐;瘙痒部位不同用药有别[N];健康时报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978