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雷公藤化学成分与多组分含量测定研究

吴春敏  
【摘要】: 雷公藤俗称山砒霜,系卫矛科雷公藤属植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.多年生藤本植物植物,分布于长江流域以南各地及西南地区。雷公藤疗效确切但有大毒,传统以去皮的雷公藤木质部入药,现也有用带皮的根及叶入药。雷公藤具有抗炎、抗自身免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗HIV及潜在的治疗Alzheimer’s疾病的作用,广泛用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎等自身免疫性疾病。雷公藤临床上治疗指数低,不良反应发生率远高于其他药物,主要发生在消化系统、泌尿系统、生殖系统、心血管系统、骨髓及血液系统。 雷公藤化学成分复杂,特别是有些微量成分具有很强的生物活性,主要活性成分雷公藤内酯醇、雷公藤红素,它们即是有效成分也是毒性成分。迄今已从雷公藤属植物中共分离并鉴定出近300种化合物,主要为倍半萜类(包括倍半萜生物碱)、二萜类、三萜类化合物,有约100种化合物实验证实具有生物活性,活性强弱依次为二萜类、生物碱类和三萜类。至今仍不断有从雷公藤及其同属植物分离出新化合物的报道。 为了进一步弄清雷公藤药效及毒性物质基础,保证临床用药的安全有效,本研究对雷公藤根皮及去皮木质部乙酸乙醋提取部位,以各种色谱分离技术分离单体,并以此为基础,建立多指标含量测定方法。 一、雷雷雷雷公公公公藤藤藤藤化化化化学学学学成成成成分分分分的的的研研究雷公藤根皮毒性相当大,在临床上主要应用去皮木质部作为药用部位。由于雷公藤根皮、木质部所含的物质基础不同,本实验将雷公藤根部位分为根皮与木质部分别进行化学成分研究。分别从雷公藤根皮与木质部的乙酸乙酯提取部位,以各种色谱分离技术,包括硅胶色谱、凝胶渗透色谱和液相色谱分离等手段,分得23个单体化合物。各单体化合物以多种有机波谱解析方法,包括HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, COSY,HMBC等波谱手段进行鉴定,23个鉴定的化合物中有5个为文献未见报道的新化合物。 从雷公藤根皮中共分得20个化合物。分别为:12,14-Dihydroxy-3-oxo-abieta- 8,11,13-triene (7)、3,4,6-Ttrihydroxy-2-oxo-23,24-nor-D:A-Friedooleana-1,3,5(10),7– tetraene -29-oic acid (14)、9′-Hydroxy-2-nicotinoylwilforine (21)、1-Desacetylwilforgine (22)、1-Desacetlwilforine (23)、雷酚内酯(Triptophenolide) (1)、雷公藤酮(Triptonide) (2)、雷公藤内酯醇(Triptolide) (3)、雷酚酮内酯(Triptonolide ) (4)、Salaspermic acid (8)、Orthosphenic acid (9)、雷公藤红素(Celastrol) (10)、29-hydroxyfredelan-3-one (11)、Demethylzeylasteral (12)、雷公藤春碱(Wilfortrine) (15)、雷公藤碱(Wilfordine)(16)、雷公藤晋碱(Wilforgine)(17)、雷公藤次碱(Wilforine) (18)、Wilfornine (19)、雷公藤碱戊(Wilforidine)(((( 22200),其中化合物7、14、21、22和23为新化合物。 从雷公藤木质部中共分得4个化合物,分别为: Triptonoterpene(5)、Triptoquinone A(6)、Orthosphenic acid (9)雷藤三萜酸B(3β-22βDihydroxy- olcan -12-en-29-oic acid )(13)。 本研究从雷公藤根皮及木质部部位中共分得23个化合物,Orthosphenic acid为木质部和根皮所共有的成分,结构类型包括了二萜类,三萜类,生物碱类,其中有5个为新化合物。新化合物为萜类和生物碱类,新化合物21,22,23为倍半萜大环内酯类生物碱,均是wilfordate型生物碱;新化合物7为雷酚萜类松香烷型二萜,其在苯环上同时有两个羟基取代,丰富了该类二萜的取代基类型;新化合物14为木栓烷型母核结构的三萜类化合物。以上的新发现丰富了雷公藤属植物的生物碱及萜类结构,扩大了其化合物结构的多样性,为进一步研究和开发雷公藤打下一定基础。 二、雷雷雷雷公公公藤藤多组组组组分分分分含含含含量量量测测定研研究 建立了液相色谱法测定雷公藤中的11种有效成分—雷公藤内酯醇(ttriptolide)、雷公藤碱戊(wilforidine)、雷公藤春碱(wilfortrine)、雷酚内酯(triptophenolide)、雷公藤碱(wilfordine)、雷公藤晋碱(wilforgine)、雷酚酮内酯(triptonolide)、雷公藤次碱(wilforine)、Demethylzeylasteral、雷公藤红素(celastrol)及雷公藤酯甲(wilforlide A)的含量。采用快速液相色谱系统,用ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 X 100mm,1.8 m)色谱柱,以乙腈-水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5ml.min-1;检测波长为220nm和210nm。结果被测的11个成分在各自浓度的范围内线性关系良好,平均回收率为95.6%-103.5%,RSD为1.1%-4.8%。 由于雷公藤根皮、木质部、茎、叶化学成分差异较大,本次实验将雷公藤药材分为根皮、木质部、茎及叶四个部分,并采用OASIS? HLB 3cc(60mg)固相萃取小柱对样品进行分离与富集。研究结果表明:茎、叶所含成分较去皮木质部、根皮少,几乎不含生物碱类成分,主要含极性较大的成分及未被鉴定的三萜类成分。我们对8份GAP基地样品及3份野生采集的全株样品分成4个不同的药用部位,根皮、木质部、茎及叶进行分析,结果发现主要的活性成分雷公藤内酯醇、雷公藤红素及生物碱主要存在于根皮中,基地的8份根皮样品,每g含雷公藤红素在6030-14463 g之间,而木质部样品雷公藤红素在0-569 g之间,与根皮结果差异甚大,雷公藤内酯醇也是根皮含量高,每g含量在29-98 g之间,而木质部每g含雷公藤内酯醇量仅在0-18 g之间。每g根皮样品含有mg级的生物碱主要有雷公藤春碱、雷公藤晋碱与雷公藤次碱。基地样品与野生样品比较,基地样品所含的活性成分比野生样品成分多且含量高。比较6月与10月份同为GAP基地采集的雷公藤样品,结果10月份采集样品二萜类、生物碱类及三萜类含量均高于6月份采集的样品,再次验证了雷公藤合理的采收季节为秋季。对2份07年与09采集的直径约为4cm-6cm的野生粗根样品进行分析,发现雷公藤内酯醇含量比细根低,与文献报道的结果一致,提示根可在低龄采用,以提高经济效益。研究还发现,秋季采收的叶子中含有较高的雷公藤内酯醇,最高的达到每g含90 g,比木质部高出数倍,这为今后合理利用雷公藤药用资源提供了依据。 Wilforlide A是雷公藤木质部制剂雷公藤多甙片的含量控制指标。本研究利用HPLC的二级管阵列检测以及质谱的鉴定功能,对样品中目标化合物进行测定,结果木质部与茎在与Wilforlide A保留时间相差±0.5min处,出现色谱峰且光谱图与Wilforlide A对照品光谱图一致;质谱分析,未能提取到Wilforlide A分子离子峰,初步判断本次研究的样品中不含Wilforlide A。 总之,本研究通过对雷公藤化学成分及不同药用部位木质部、根皮、茎、叶中的二萜类、生物碱类及三萜类共11种成分的含量测定,证明雷公藤不同药用部位成分差别非常显著,主要的活性成分和毒性成分集中在根皮,秋季采集的叶子中含有较高含量的药效活性成分环氧二萜化合物雷公藤内酯醇。这些研究结果为雷公藤药材资源的进一步合理利用及保证临床雷公藤用药的安全、有效和可控提供了技术支持与基础研究数据。


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